Etude d’un extrait enrichi en stilbènes complexes pour le contrôle des maladies du vignoble

Abstract

Grapevine (Vitis vinifera L.) is one of the most widely grown crops in the world and represents a major economic importance. It is subject to many diseases and the most common have fungal origin. In France, amongst the most damaging diseases, we can cite Plasmopara viticola, the agent responsible for downy mildew, and Botrytis cinerea, the agent of grey mould. The control of these diseases is largely done by the use of pesticides derived from chemical synthesis. However, these compounds have harmful effects on the environment and human health. Face to these issues, alternative solutions must be developed and proposed such as the use of natural products with antimicrobial activity and preferably from agricultural by-products. In this study, we considered the possibility to use extracts enriched in stilbenes which are plant metabolites with antioxidant and antimicrobial properties, as an alternative approach for disease control. Stilbenes are synthesized by several plant species including the grapevine that present simple stilbenes and also complex tetramers of resveratrol. These latter compounds are mainly present in the perennial parts of the plant, namely the shoots, vines and roots. These oligomerized stilbenes have powerful antimicrobial activities. Thus, an extract enriched in stilbenes from grapevine trunks and roots was produced. An optimization of the method of extraction of complex stilbenes was performed. In order to produce this extract with a sustainable approach, we compared two solvents considered “green”, ethanol and ethyl acetate. We selected ethyl acetate for its greater efficiency of extraction and we carried out, more precisely, two successive extractions with the following solvent proportions: 100 - 85%. The obtained extract is rich in stilbenes (50% of the extract) and contains in particular complex forms (dimers and tetramers). In laboratory, the extract demonstrated a strong oomycidal activity against vine mildew, P. viticola. A formulation was developed to optimize the efficiency of the extract and to be able to study its activity in natura. In greenhouse, the extract showed a capacity to reduce the severity of the disease by 40% and up to 50% when formulated. In addition, the application of the extract on grapevine leaves triggers some plant defence responses. Regarding the effect of the stilbenes extract on B. cinerea, a strong fungicidal activity was noted. We determined the stilbenes responsible of this activity among the major stilbenes of the extract: the most active are r-viniferin, resveratrol and ε-viniferin. In addition, considering that some enzymes of the B. cinerea secretome, namely laccases, can dimerize certain stilbenes, we followed the action of such enzymes on the stilbenes of our extract and we determined the fungicidal activity of the biotransformed extract. We showed that several stilbenes of the extract, especially dimers, are transformed, while others are not, as most of the tetramers. Thus, for the first time, with these experiments, we demonstrated the formation of hopeaphenol, r-viniferin and r2-viniferin from ε-viniferin. The anti-Botrytis activity of the biotransformed extract is only slightly affected. In addition, we noted that the stilbenes extract has a negative effect on the production of laccases. All together, these results confirm the relevance of pursuing the development of extracts enriched in oligomerized stilbenes for their potential use as an alternative approach for the prevention and control of P. viticola and B. cinerea in vineyards.La vigne (Vitis vinifera L.) est une des cultures les plus largement répandues dans le monde et présente une importance économique majeure. Elle est sujette à de nombreuses maladies dont les plus répandues sont d’origine fongique. En France, parmi les maladies les plus dommageables nous pouvons citer Plasmopara viticola, agent responsable du mildiou, et Botrytis cinerea, agent de la pourriture grise. Le contrôle de ces maladies est largement effectué par l’application de pesticides issus de synthèse chimique. Or, ces composés présentent des effets néfastes sur l’environnement et la santé humaine. Face à ces problématiques, des solutions alternatives doivent être développées et proposées telle que l’utilisation de produits naturels dotés d’activité antimicrobienne préférentiellement obtenus à partir de co-produits de l’agriculture. Dans cette étude, nous avons considéré la possibilité d’utiliser des extraits enrichis en stilbènes, des métabolites végétaux aux propriétés antioxydantes et antimicrobiennes, comme solution de biocontrôle des maladies. Les stilbènes sont synthétisés par plusieurs espèces végétales dont la vigne qui présente une forte diversité de stilbènes dont des tétramères du resvératrol. Ces dernières molécules sont en quantité importante dans les parties pérennes de la plante (sarments, ceps et racines). De plus, l’efficacité antimicrobienne de tels stilbènes oligomérisés est remarquable. Ainsi, nous avons choisi de produire un extrait enrichi en stilbènes à partir de ceps et de racines de vigne. Une optimisation de la méthode d’extraction des stilbènes complexes a été mise en œuvre. Dans le but de produire un extrait selon une approche durable, nous avons comparé deux solvants dits « verts », l’éthanol et l’acétate d’éthyle. Nous avons retenu l’acétate d’éthyle pour sa plus grande efficacité d’extraction. Deux extractions successives dans les proportions en solvant de 100 puis de 85 % permettent l’obtention d’un meilleur rendement. L’extrait obtenu est riche en stilbènes (50% de l’extrait) et contient des formes complexes (dimères et tétramères). Au laboratoire, cet extrait a démontré une forte activité oomycide contre le mildiou de la vigne, P. viticola. Une formulation a été développée afin d’optimiser l’action de l’extrait et de pouvoir évaluer son efficacité in natura. En serre, l’extrait a montré une capacité de réduction de la sévérité de la maladie de 40 % et jusqu’à 50 % lorsque formulé. De plus, l’application de l’extrait sur les feuilles de vigne déclenche des réponses de défense chez la plante. Concernant l’effet de l’extrait stilbénique envers B. cinerea, une forte activité fongicide a été relevée. Nous avons déterminé les stilbènes responsables de cette activité parmi les stilbènes majeurs de l’extrait : les plus actifs sont la r-viniférine, le resvératrol et l’ε-viniférine. Par ailleurs, informés que certaines enzymes du sécrétome de B. cinerea, les laccases, peuvent dimériser certains stilbènes, nous avons suivi l’action de telles enzymes sur les stilbènes de notre extrait puis déterminé l’activité fongicide de l’extrait biotransformé. Nous avons montré que plusieurs stilbènes de l’extrait, notamment des dimères, sont transformés, alors que d’autres ne peuvent l’être, tel la plupart des tétramères. Ainsi, pour la première fois, par ces travaux, nous avons mis en évidence la formation d’hopéaphénol, de r-viniférine et de r2-viniférine à partir d’ε-viniférine. L’activité anti-Botrytis de l’extrait biotransformé n’est que peu impactée. De plus, nous avons noté que l’extrait de stilbènes agit de façon négative sur la production de laccases. L’ensemble de ces résultats confirment la pertinence de poursuivre le développement d'extraits enrichis en stilbènes oligomérisés pour leur utilisation potentielle comme approche alternative pour la prévention et le contrôle de P. viticola et B. cinerea dans les vignobles