Papel de los microRNAs en la angiogénesis del cáncer de mama y en la respuesta angiogénica a la quimioterapia

Abstract

INTRODUCCIÓN: La angiogénesis es el proceso fundamental por el cual se forman nuevas redes capilares. Los tumores precisan de neovascularización para su crecimiento y progresión más allá de aproximadamente un milímetro de diámetro, de forma que las redes capilares permiten el aporte de nutrientes y oxígeno, así como la eliminación de sustancias de desecho, además de permitir la diseminación metastásica. Los microRNAs son pequeños RNA no codificantes que se encargan del bloqueo de la expresión génica mediante mecanismos de silenciamiento traduccional. Existen múltiples evidencias que muestran que los microRNAs desempeñan papeles importantes en la regulación del proceso angiogénico, actuando (dependiendo de sus dianas) como agentes pro- o antiangiogénicos. La angiogénesis ha demostrado ser una diana útil en el tratamiento antiangiogénico; sin embargo, sus resultados son todavía limitados y se necesita profundizar en los mecanismos moleculares que regulan la activación angiogénica, así como la búsqueda de factores predictivos y pronósticos que permitan la estratificación de las pacientes en el contexto del cáncer de mama. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS: La hipótesis de partida es que los microRNAs juegan un papel relevante en la angiogénesis del cáncer de mama, fundamentalmente a través de la modulación de los niveles de expresión de VEGFA, THBS1 y otros genes claves de este proceso. El objetivo fue evaluar el papel del clúster miR-17-92, así como otros angiomicroRNAs en la angiogénesis del cáncer de mama. MATERIAL Y MÉTODOS: Se estudió una serie clínica con 121 pacientes con cáncer de mama localmente avanzado tratadas homogéneamente con quimioterapia neoadyuvante basada en antraciclinas y taxanos secuenciales. Se obtuvo RNA de biopsias FFPE pre- y postquimioterapia y se analizó la expresión génica de microRNAs y mRNAs, estudiando la asociación entre la expresión de estos y las características anatomopatológicas de los tumores y su relevancia predictiva de respuesta y en supervivencia. Así mismo, se analizaron por técnicas inmunohistoquímicas y morfométricas las redes capilares peritumorales utilizando tinción con anticuerpo anti-CD34. Se realizó paralelamente un estudio in silico de interacción entre microRNAs y sus posibles mRNA dianas. Los resultados observados clínicamente se correlacionaron con los obtenidos en el laboratorio construyendo modelos mediante técnicas in vitro que incluyeron cultivo celular, transfección celular, tratamiento con taxanos, evaluación de la formación de redes capilares en medio condicionado tumoral, western-blot, RT-qPCR, migración, invasión, apoptosis, proliferación y microarrays de expresión génica. Los resultados obtenidos se validaron utilizando bases de datos externas y una serie de cáncer de mama adyuvante con RNA extraído de tejido fresco. RESULTADOS: La serie clínica correspondió en su mayoría a tumores de subtipo luminal con estadios localmente avanzados, y la tasa global de respuestas completas patológicas (17%) fue comparable a la publicada. El RNA extraído de parafina fue suficiente para realizar análisis de la expresión génica en la mayoría de los casos. El estudio in silico permitió una buena selección de genes candidatos para estudio in vitro. La mayoría de los microRNAs correlacionaron directamente con factores de proliferación e inversamente con factores implicados en quimiotaxis y angiogénesis. La expresión pre-tratamiento de los microRNAs y mRNAs seleccionados no tuvo valor predictivo de respuesta ni valor pronóstico, pero miR-429 tuvo valor pronóstico adverso para supervivencia libre de enfermedad y libre de recaída a distancia. Identificamos un perfil vascular de alto riesgo compuesto por tamaño vascular grande y presencia de proliferaciones microvasculares glomerulares. Cuando se analizó la relación entre la expresión de miRNA y el patrón vascular, observamos que miR-19b-1 y miR-20a se asociaban con el perfil de alto riesgo descrito. En general, la quimioterapia indujo un aumento de expresión de microRNAs y genes importantes en angiogénesis, mientras que provocó un descenso de genes de proliferación. En particular, la quimioterapia neoadyuvante aumentó la densidad microvascular y el área vascular, sin cambios en el tamaño medio de los vasos, aunque aproximadamente un tercio de los casos mostraron respuesta angiogénica, definida como disminución de microdensidad vascular. Solo miR-19b-1 tuvo valor predictivo de respuesta angiogénica. De forma independiente a la regulación de la angiogénesis, miR-18a mostró ser un oncomiR con impacto pronóstico en el tumor residual, reprogramando las células hacia un estado pro-proliferativo y disminuyendo los niveles de receptor de estrógenos alfa y de SDF-1. CONCLUSIONES: MiR-17-92 desempeña un papel relevante en la angiogénesis tumoral, asociándose sus miembros de forma directa con un estado proangiogénico y proproliferativo, a través de biomarcadores tan importantes como el factor de crecimiento endotelio vascular o la trombospondina-1. Todos los angiomicroRNA analizados en este trabajo de tesis (miR-17, miR-18a, miR-19b-1, miR-20a, miR-92a, miR-200c, miR-106b, miR-429, miR-141, miR-519c, miR-9 y miR-107) sufren un aumento de expresión consistente en el contexto del tratamiento con quimioterapia neoadyuvante basada en antraciclinas y taxanos. Mir-18a es potencialmente relevante como factor pronóstico en pacientes sin respuesta completa post-neoadyuvancia. ABSTRACT INTRODUCTION: Angiogenesis, a process by which novel blood vessels are formed, is a key step for tumor growth and progression. MicroRNAs are small non-coding RNAs that regulates gene expression by blocking protein translation. There are multiple evidences showing that microRNAs play an important role in tumor angiogenesis regulation,, acting both as pro- or antiangiogenic agents. Although angiogenesis is as useful target for cancer treatment, their clinical results are limited and a deeper understanding of its molecular mechanisms is required both to improve treatment results and its predictive and prognostic relevance for patient stratification in the context of breast cancer. HYPOTHESIS AND OBJECTIVES: Our hypothesis was that microRNAs play a relevant role in angiogenesis regulation of breast cancer, through modulation of expression levels of VEGFA, THBS1 or other key angiogenic genes. Our objective was to evaluate the role of cluster miR-17-92 as well as other angiomicroRNAs in breast cancer angiogenesis. MATERIAL AND METHODS: A total of 121 patients with locally advanced breast cancer were recruited for the study. Patients were homogeneously treated with sequential anthracyclines and taxanes. RNA was obtained from pre- and post-chemotherapy FFPE specimens and gene and microRNA expression was analyzed. Association of gene expression and pathological characteristics was analyzed, as well as with response and prognosis. We analyzed tumor vessel networks by immunohistochemistry (anti-CD34) and morphometry. In parallel, we performed an in silico study of interaction between microRNAs and their mRNAs of protein-coding genes candidates. Clinical results were complemented by experimental studies within vitro models including cell culture, cellular transfection, treatment with taxanes, evaluation of vessel formation in vitro with conditioned tumor medium, western-blot, RT-qPCR, migration, invasion, apoptosis, proliferation as well as DNA microarrays for gene expression. Results were validated in external series as well as in an independent adjuvant breast cancer series of frozen tissues. RESULTS: Our clinical series mainly included luminal locally advanced breast cancer patients, and pathological complete response rate (17%) was similar to previously reported series.RNA obtained from FFPE samples was sufficient for gene expression analyses in the majority of cases. In silico study allowed us to appropriately select candidate genes for in vitro studies. Most microRNAs correlated with proliferative factors, and inversely with chemotaxis and angiogenic factors expression. MicroRNA and mRNA expression of most selected candidates miRNAs did not show any association with pathologic complete response or prognosis, but miR-429 showed an adverse prognostic for disease-free and distant relapse-free survival. We identified a high risk vascular profile comprising both high vessel size and presence of microvascular glomeruloid proliferations, and associated with higher miR-19b-1 and miR-20a expression. Chemotherapy induced an increase in the expression of all microRNAs studied and of many angiogenesis-related factors, while significantly downregulated proliferation genes. Chemotherapy induced an increase of microvessel density and vascular area without changes in the vessel size. Angiogenic response (a decrease in microvascular density) was only found in a third of patients, and was predicted by miR-19b-1. MiR-18a was shown to be an oncomiR with a prognostic impact of its expression in post-chemotherapy residual tumor, reprogramming tumor cells to a pro-proliferative status and downregulating estrogen receptor alpha and SDF-1. CONCLUSIONS: MiR-17-92 has a relevant role in tumor angiogenesis, by association of their members with a pro-angiogenic and pro-proliferative status, through modulation of VEGFA and thrombospondin-1 expression. All analyzed angiomicroRNA (miR-17, miR-18a, miR-19b-1, miR-20a, miR-92a, miR-200c, miR-106b, miR-429, miR-141, miR-519c, miR-9 and miR-107) increased their expression after anthracyclines and taxanes neoadjuvant chemotherapy. Mir-18a is a potential prognostic factor for those patients with residual tumor after neoadjuvant treatment