The main objective of the current study was to isolate bacterial strains able to biodegrade the emerging pollutants paracetamol (APAP) and hydroquinone (HQ), amongst the most worldwide prescribed drugs, also frequently detected in wastewater treatment plants influents and effluents and the environment.
The most promising microbial consortia of Poderosa and Lousal mines for APAP removal were selected based on the previous reports of PROBIOMA project (European Regional Development Fund ERDF - Interreg V-A Spain-Portugal program (POCTEP)). The ability of the selected microbial consortia to remove APAP from the Mineral Salt Medium (MSM) at an initial concentration of about 500 mgL-1 (MSM-APAP (500 mgL-1)), under dark shaking conditions of 160 rpm at 25 °C, was confirmed using UV-vis molecular spectroscopy.
Subsequently, the isolation step from selected samples proceeded from three successive enrichment cultures using MSM-drug (500 mgL-1) under the aforementioned conditions by spreading first on LB-drug and then on MSM-drug (500 mgL-1) agar plates and resulted in seven isolates able to utilize APAP as sole carbon source, and identified according to 16S rRNA gene sequence analysis as members of genera Aeromonas, Bacillus (two isolates), Niallia, Paraburkholderia, Rhizobium, and Variovorax, as well as one HQ utilizing isolate (Mycolicibacterium sp.).
The HPLC analysis of APAP removal, in MSM-APAP (500 mgL-1) under the same culture conditions, by the two putative APAP biodegrading Bacillus sp. isolates revealed that Bacillus sp. (PDE3.1) showed maximal APAP %removal of 63+3 after 18 days, while Bacillus. sp. (PLC2.1) showed %removal of only 8+1 at the end of the experiment after 21 days. The key metabolites of APAP degradation (4-aminophenol and HQ) were detected through GC-MS analysis in the experiment with Bacillus sp. (PDE3.1) at very low concentrations.
Then, the seven potential APAP biodegrading bacterial isolates were tested for APAP removal in MSM at a lower concentration of 50 mgL-1. Rhizobium sp. (PDE3.3) and Paraburkholderia sp. (PLA3.3) seemed the most promising where APAP %removal was 49±4 and 47.9±0.9, respectively. Later, the co-culture of the three most promising isolates (Rhizobium sp. (PDE3.3), Paraburkholderia sp. (PLA3.3), and Bacillus sp. (PDE3.1) didn’t improve the %removal compared with the pure cultures, while the co-culture with the seven potential APAP biodegrading isolates did not show removal capacity. Mycolicibacterium sp. (HPB1.1) showed at least 88% removal of HQ from MSM-HQ (50 mgL-1) after four days; hence, was checked for APAP removal in MSM-APAP (50 mgL-1) and showed APAP %removal of 41.6±0.1. Overall, some bacterial strains isolated from Poderosa and Lousal mines showed removal capacity; hence, more efforts should be directed at investigating if biodegradation is the main removal mechanism involved, and at exploring the biodegradation potentials of The Iberian Pyrite Belt mines associated bacteria.As crescentes preocupações ambientais sobre a incapacidade das estações de tratamento de águas residuais (ETARs) para remover completamente os produtos farmacêuticos e outros poluentes das águas residuais, são apoiadas por estudos que reportam as ETAR como a principal fonte de poluentes emergentes no ambiente aquático. Desde a década de 80 que a aplicação da tecnologia de bioaumentação em sistemas de ETAR convencionais usando estirpes bacterianas com as capacidades de biodegradação desejadas tem recebido atenção com o objetivo da remoção completa dos medicamentos contaminantes das águas residuais antes da liberação no meio ambiente. Por outro lado, ambientes extremos sempre foram considerados como uma fonte valiosa de estirpes microbianos com extraordinários potenciais metabólicos considerados como mecanismos de adaptação às condições circundantes de habitats tão extremos, permitindo que esses micróbios extremófilos dominem e se sobreponham a outras comunidades microbianas. O principal objetivo do presente estudo foi isolar e identificar estirpes bacterianas com potencial metabólico para biodegradar o poluente emergente paracetamol (APAP) e seu metabólito hidroquinona (HQ) em ETARs. A escolha do APAP como modelo de estudo deve-se à sua classificação entre os medicamentos mais prescritos no mundo, à sua deteção frequente em afluentes e efluentes de ETARs e no meio ambiente, bem como sua inclusão na Lista Modelo da Organização Mundial da Saúde de Medicamentos Essenciais. Para monitorização da remoção de APAP e HQ foram utilizados diferentes métodos de análise em diferentes fases do trabalho: absorvância de UV-vis em leitor de placas, HPLC com detetor de UV-vis e GC-MS. A análise espectral de UV-vis em leitor de placas foi usada para monitorizar APAP e HQ nas culturas de enriquecimento dos consórcios microbianos utilizados para os isolamentos, o HPLC foi utilizado nos estudos de remoção com os isolados selecionados e o GC-MS para detetar produtos da degradação do APAP. Para a construção de retas de calibração a usar nas análises das amostras fizeram-se os seguintes testes e/ou afinações: no leitor de placas foram selecionados comprimentos de onda com picos de absorbância em soluções padrão dos compostos APAP e HQ; no HPLC determinaram-se os tempos de retenção destes compostos e também do metabolito 4-aminofenol com um método previamente utilizado para estes compostos em trabalhos anteriores já publicados pelo grupo onde o trabalho foi efetuado, no GC-MS testou-se um método previamente utilizado pelo grupo para análises de outro fármaco (17α-etinilestradiol) e determinaram-se os tempos de retenção dos compostos em estudo neste trabalho. Os consórcios microbianos mais promissores das minas Poderosa e do Lousal para biodegradação de APAP foram selecionados com base nos relatórios anteriores do projeto PROMIOMA. A capacidade dos consórcios microbianos selecionados de biodegradar APAP em meio mineral MSM suplementado com uma concentração de 500 mgL-1 (MSM-APAP (500 mgL-1)), no escuro sob condições de agitação de 160 rpm a 25 °C, foi confirmada por análise de absorbância de UV-vis. Subsequentemente, a etapa de isolamento fez-se a partir de três culturas de enriquecimento sucessivas em MSM-APAP (500 mgL-1) nas condições descritas, por espalhando primeiro em placas de LB-agar e depois em placas de MSM-agar-APAP (500 mgL-1), e resultou em sete isolados potencialmente degradadores de APAP identificados de acordo com análises das sequências do gene ARNr 16S como membros dos géneros Aeromonas, Bacillus (dois isolados), Niallia, Paraburkholderia, Rhizobium e Variovorax. Foi também selecionado um isolado degradador de HQ identificado como Mycolicibacterium sp.. Estes géneros, exceto o Bacillus, são relatados pela primeira vez para a biodegradação de APAP. As análises por HPLC da biodegradação do APAP, em MSM-APAP (500 mgL-1) nas mesmas condições de cultivo, pelos dois Bacillus sp. revelaram que o isolado Bacillus sp. (PDE3.1) mostrou uma percentagem máxima de remoção de APAP de 63±3 após 18 dias, enquanto o isolado Bacillus. sp. (PLC2.1) mostrou apenas 8±1% de remoção no final da experiência. Nenhum dos principais metabólitos da degradação do APAP (HQ e 4-aminofenol) foi detetado por análise de HPLC, no entanto eles foram detetados na análise por GC-MS, ainda que em concentrações baixas, na experiência com o Bacillus sp. PDE3.1, sugerindo que a biodegradação do APAP pode ter ocorrido através da descarboxilação inicial do APAP em 4-aminofenol no qual o grupo amina é depois substituído pelo grupo hidroxilo produzindo-se HQ. Os sete isolados bacterianos potencialmente biodegradadores de APAP foram também testados quanto à biodegradação de APAP em MSM numa concentração mais baixa: 50 mgL-1. Nestes testes, os isolados Rhizobium sp. (PDE3.3) e Paraburkholderia sp.(PLA3.3) pareceram os mais promissores, com com % de remoção de APAP de 49±4 and 47,9±0,9, respectivamente. Posteriormente, uma co-cultura dos três isolados mais promissores (Rhizobium sp. (PDE3.3), Paraburkholderia sp. (PLA3.3) e Bacillus sp. PDE3.1) não melhorou a remoção de APAP em comparação com as culturas de isolados puros, enquanto uma co-cultura com todos os sete isolados potencialmente biodegradadores de APAP não apresentou capacidade degradadora. Por outro lado, o isolado Mycolicbacterium sp. (HPB1.1) revelou pelos menos 88% de remoção de HQ após quatro dias numa experiência em MSM-HQ (50 mgL-1). Portanto, este promissor isolado foi também testado para biodegradação em MSM-APAP (50 mgL-1), tendo sido comprovada a remoção de 41,6±0,1% do APAP inicial com uma concentração residual de 29,34±0,05 mgL-1. Por fim, o isolado Mycolicibacterium sp. (HPB1.1) foi selecionado para trabalhos futuros e foi cultivado em meio LB (pH 7) a 25°C sob condições de agitação (160 rpm) para estudo da cinética de crescimento da cultura ao longo de 68 h, com base na densidade ótica a 600 nm (OD600) de amostras em intervalo de 2 h. As células cresceram exponencialmente sem fase lag visível e o crescimento exponencial, associado ao crescimento mais rápido com coeficiente de determinação R2 de 0,99, estendeu-se até 36 h onde foi alcançado uma OD600 máxima de 1,27. A taxa de crescimento específico μ durante o crescimento exponencial foi calculada como 0,047 h-1. Depois, uma fase de desaceleração ou aceleração negativa de crescimento parece seguir-se ao crescimento exponencial e estender-se das 36 h até às 42 h, onde a fase estacionária parece começar e durar até às 68 h, havendo depois uma diminuição da OD600
