Biopharmaceuticals are a natural alternative to chemically synthesized pharmaceuticals. They can be based on enzymes, hormones, monoclonal antibodies, cytokines, among others; and are already applied in the treatment of many diseases that do not reply to common therapies.
The enzyme L-asparaginase (L-ASNase) is a biopharmaceutical already used in treatments of many leukemias, namely Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL), or Hodgkin’s disease. Particularly, in ALL, type of leukemia that attacks mostly children and young people, L-ASNase acts as an inhibitor of the carcinogen cells growth. However, the L-ASNase commercially available, and from Escherichia coli, contains a high activity of L-glutaminase, causing side effects, for example edema, fever, diabetes and haemorrhages, in the patients. Therefore, the search for new microorganisms that produce L-ASNase with decreased secondary effects is of extreme importance. In this work, a recombinant L-ASNase was produced from Bacillus Subtilis. After that, as the conventional methods for the purification of this enzyme are very expensive, it was developed a new purification technique for L-ASNase, more economical, through the usage of supported ionic liquids (SIL).
Three SILs were synthesized and characterized, and different experimental conditions were tested, in order to optimize the purification process of L-ASNase, namely the cell extract total protein concentration and the material/cell extract ratio. At last, a semi-continuous assay was performed with the optimized conditions.
The results obtained demonstrate that optimum experimental conditions for L-ASNase purification occur at a cell extract concentration of 16.7 mg/mL (original total protein concentration after cell lysis) and 50 mg of material per each mL of cell extract, corresponding to a specific activity of L-ASNase of 0.0382 U/mg and a purification fold of 3.46.Os biofármacos são uma alternativa natural aos fármacos quimicamente sintetizados. Estes podem ter como base enzimas, hormonas, anticorpos monoclonais, citocinas, entre outros; e já são aplicados no tratamento de diversas doenças que não respondem às terapias comuns.
A enzima L-asparaginase (L-ASNase) é um biofármaco atualmente usado no tratamento de diversas leucemias, nomeadamente a Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), ou doença de Hodgkin. No caso específico da LLA, tipo de leucemia que ataca maioritariamente crianças e jovens, a L-ASNase atua como um inibidor do crescimento das células cancerígenas. Porém, a L-ASNase atualmente comercializada, e proveniente de Escherichia coli, contém uma atividade elevada de L-glutaminase, provocando efeitos secundários, como edema, febre, diabetes e hemorragias, nos pacientes. Deste modo, a busca por novos microorganismos que produzam L-ASNase com efeitos colaterais diminuídos é de extrema importância. Neste trabalho, produziu-se uma L-ASNase recombinante por Bacillus Subtillis. Posteriormente, e uma vez que os métodos convencionais para a purificação desta enzima são muito dispendiosos, desenvolveu-se uma nova técnica de purificação para a L-ASNase mais económica através da utilização de líquidos iónicos suportados (LIS).
Foram sintetizados e caracterizados três LIS e testaram-se diferentes condições experimentais de forma a otimizar o processo de purificação da L-ASNase, nomeadamente a concentração do extrato celular e a razão material/extrato celular. Por fim, efetuou-se um ensaio em semi-contínuo, com as condições já otimizadas.
Os resultados obtidos indicam que as condições ótimas de purificação da L-ASNase ocorrem com uma concentração de proteína total do extrato celular de 16.7 mg/mL (concentração de proteína total obtida após a lise celular) e uma massa de 50 mg de material por cada mL de extrato celular, correspondentes a uma atividade específica de L-ASNase de 0.0382 U/mg e fator de purificação de 3.46.Mestrado em Engenharia Químic
