Tese de mestrado, Engenharia Biomédica e Biofísica, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasThe RANK-RANKL interaction, and consequently, the RANK-TRAF6 pathway, is involved in several fundamental biological cycles, such as cell growth, apoptosis, osteosteoclastogenesis and inflammatory responses. As a result of partaking in such important processes, it is also implied that this pathway is related to severe pathologies, such as osteoporosis and breast or prostate cancer-induced bone
metastasis. Currently, one of the therapeutic approaches to treat such diseases lies in the inhibition of
RANK-RANKL interaction. Nonetheless, considerable interest arose in an alternative route, namely the
inhibition of the RANK-TRAF6 pathway. This process is achievable, for example, by the interference
of RANK’s interaction with TRAF6 using decoy peptides (e.g., L-T6DP-1).
8 Thus, the objective of this
project was to synthesize, purify and biologically evaluate two peptides (3A and its negative control,
3B) containing a cell penetrating sequence (KLFMALVAFLRFLT), combined with sequences designed
in silico to interfere with the RANK-TRAF6 pathway (RQMATADEA and RQMPTEDEY). Furthermore, biodistribution studies of peptides 3A and 3B, modified with a gallium-67 chelator were aimed to
be achieved, in in vivo animal models, by micro-PET-SPECT-CT imaging. The aforementioned studies
were not performed, as during the process, several issues arose. Some include long amino acid coupling
times and difficulty radiolabeling peptide 3A. These adversities led to an overall unsuccessful procedure,
requiring further optimization. Although the image acquisition of the synthesized peptides was impossible at this time, it was deemed that the equipment validation should still be made using an alternative
compound that is currently being investigated by the C2TN-IST group: a 67Ga-radiolabeled gold nanoparticle named 67Ga-AuNP-BBN-Pt1.A interação RANK-RANKL, e consequentemente a via RANK-TRAF6, encontra-se envolvida em
diversos ciclos biológicos fundamentais, tais como o crescimento celular, apoptose, osteoclastogénese,
e respostas inflamatórias. No seguimento da interferência em tais processos, é implícito que a disrupção
do normal funcionamento desta interação possa resultar em patologias severas, das quais se destacam
osteoporose, ou, em casos mais extremos, metástases ósseas resultantes de cancro da mama ou da
próstata. Considerem-se, por exemplo, pacientes diagnosticados com cancro da mama ou da próstata.
As células tumorais deste tipo de cancros expressam fatores osteoclastogénicos capazes de alterar o
microambiente do osso, como interleucinas(IL)-6 e IL-8, proteínas relacionadas com a hormona
paratiroideia (PTHrP), fatores de necrose tumoral-α (TNF-α), entre outros. PTHrP e IL-11 induzem
expressão de RANKL, enquanto suprimem a atividade do seu fator inibitório, a osteoprotegerina (OPG).
Tal favorece a interação de RANKL com o seu recetor, RANK. A interação de RANK com o seu
ligando, desencadeia uma cascata de eventos, que culmina com a ativação do fator nuclear kappa-β (NFkβ), um complexo proteico que regula mecanismos de resposta inflamatória, crescimento celular e
apoptose. Dentro destes mecanismos, encontra-se a expressão genética osteoclástica e consequente
osteoclatogénese que leva à reabsorção óssea. Encontramo-nos assim perante um loop de feedback
positivo, no qual a alteração no microambiente do osso promove o crescimento de células cancerosas,
que, por sua vez, promovem a expressão de RANKL e inibição da osteoprotegerina, desencadeando
assim a via RANK-TRAF6, que ativa NF-κB, promovendo a expressão genética osteoclástica.16, 23-24
Atualmente, uma alternativa terapêutica para o tratamento de patologias que promovam degradação
óssea (e.g. osteoporose) baseia-se na inibição da interação RANK-RANKL por ação do anticorpo
monoclonal humano Denosumab. Este anticorpo mimetiza a função da osteoprotegerina (OPG),
impedindo o RANKL de interagir com o seu recetor, RANK. Ao inibir a interação de RANK com
RANKL, favorece-se o mecanismo de remodelação óssea. Apesar de ser uma terapia inovadora, a
paragem na administração de Denosumab pode levar a uma reversão rápida da sua ação farmacológica,
turnover, muitas vezes para níveis ainda mais críticos que os anteriores ao tratamento – também
designado como ‘efeito rebound’.31 Não obstante, e tendo como inspiração o mecanismo de atuação do
Denosumab, tem surgido um interesse crescente por vias alternativas. De entre as várias possibilidades,
uma opção exequível passa pela inibição da via RANK-TRAF6. Este processo pode ser alcançado pela
inibição da interação de RANKL com TRAF6, utilizando-se por exemplo decoy peptides (e.g., L-T6DP1).
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Adicionalmente, considerando o nosso interesse no uso de péptidos como potenciais fármacos para
terapia-alvo, ou como vetores de metalofármacos para várias aplicações biomédicas, o objetivo deste
projeto contempla a síntese, purificação e avaliação biológica de um péptido (3A; KLFMALV
AFLRFLTRQMPTEDEY-NH2) e o seu controlo negativo (3B; KLFMALVAFLRF LTRQMATADEANH2) que contêm uma sequência capaz de interferir com a interação proteína-proteína RANK-TRAF6
bem como sequências “penetradoras” (do inglês: cell penetrating sequence; KLFMALVAFLRFLT).
Após a preparação dos péptidos 3A (KLFMALVAFLRFLTRQMPTEDEY-NH2) e 3B (KLFMAL
VAFLRFLTRQMATADEA-NH2), o objetivo final do estudo consistia na obtenção de imagens SPECT
da biodistribuição dos péptidos radioativos sintetizados em ratinhos saudáveis, pela técnica de
imagiologia multimodal micro-PET-SPECT-CT.
Numa fase inicial do projeto, experimentaram-se três tipos diferentes de síntese peptídica em fase
sólida: (i) síntese ‘clássica’ (‘Classical’ SPPS); (ii) síntese com assistência de ultrassons (‘US-assisted
SPPS’), e (iii) síntese com assistência de micro-ondas (‘MW-assisted SPPS’). Nesta fase, procedeu-se à
síntese de um segmento do péptido 3B (S3B; RQMATADEA-NH2), com o objetivo de comparar os
métodos de síntese peptídica em fase sólida ‘clássica’ e o mais recente método com auxílio a ultrassons. Ao finalizar a síntese pelos dois processos, verificou-se por análise RP-HPLC analítico que os
rendimentos dos “resíduos brutos” eram de 84% para o método ‘clássico’, e 72% para o método com
auxílio a ultrassons. Apesar de se ter obtido um menor rendimento de síntese, deve ser salientado que a
síntese pelo método com auxílio de ultrassons foi finalizada em cerca de um quarto do tempo. Como tal,
para a realização das sínteses subsequentes (dos péptidos 3A e 3B, e dos seus conjugados), escolheu-se
o método de síntese peptídica em fase sólida com auxílio de ultrassons.
Para a síntese do péptido 3A (KLFMALVAFLRFLTRQMPTEDEY), foram realizadas duas
tentativas: a primeira com um suporte polimérico MBHA Rink Amide, e a segunda com a resina
NovaPEG Rink Amide. No primeiro procedimento (com MBHA Rink Amide), a síntese foi terminada.
No entanto, após análise com RP-HPLC analítico (ver figura 4.4), verificou-se que mesmo que o péptido
tivesse sido sintetizado, que o processo foi concluído com um rendimento muito baixo. Visando otimizar
a síntese do péptido 3A, optou-se por utilizar, numa segunda instância, um novo suporte polimérico com
um maior loading (LoadingMBHA= 0.38 mmol/g versus LoadingNovaPEG = 0.47 mmol/g). Durante a síntese
com a nova resina, verificou-se que nos primeiros 12 aminoácidos os acoplamentos foram mais rápidos.
Contudo, ao acoplar a segunda arginina do péptido (KLFMALVAFLRFLTRQMPTEDEY), decidiu-se
dar como terminado o procedimento, dado que o tempo de acoplamento ultrapassava 8 h. Tendo chegado
a um impasse, optou-se por realizar as sínteses dos péptidos 3A e 3B, consecutivamente, pelo método
de síntese peptídica em fase sólida com auxílio a micro-ondas. Por fim, os péptidos foram sintetizados
por este método, com um rendimento moderado (53% para 3A, e 47% para 3B).
Após purificação por RP-HPLC semi-preparativo, procedeu-se ao acoplamento do linker (PEG2) e
do quelante bifuncional (NODAGA), seguindo o método de síntese peptídica em fase sólida com auxílio
a ultrassons. Subsequentemente, realizou-se a clivagem dos péptidos, purificação, e por fim,
espectrofotometria UV-Vis para determinação de concentrações, em preparação para radiomarcação.
Durante o procedimento de espectrofotometria UV-Vis, verificou-se que o péptido precipitava
subitamente e frequentemente, a temperatura ambiente. O baixo rendimento da primeira síntese, e uma
precipitação súbita a temperatura ambiente durante, levou a atribuir ao péptido 3A uma tendência a
agregar, característica de péptidos com certas sequências. Apesar de não ter sido realizada uma análise
detalhada a tal fenómeno, adotaram-se medidas preventivas, tal como a adição de uma pequena
quantidade de ácido trifluoracético à solução durante UV-Vis, e realização da técnica flash freeze após
cada utilização do péptido.
A dificuldade em manusear o péptido 3A e o seu conjugado, tornou-se especialmente evidente
durante a radiomarcação com 67Ga, a qual em condições standard se mostrou como uma
impossibilidade. Devido a restrições de tempo, não foi possível realizar a otimização do processo de
síntese dos péptidos 3A e 3B, bem como dos correspondentes conjugados, em quantidades suficientes
para se fazerem estudos de otimização da radiomarcação. Como tal, tomou-se a decisão de suspender a
utilização dos mesmos na fase final do projeto, até que as metodologias fossem revistas e otimizadas,
processo esse que se encontra de momento a ser realizado.
Para além deste trabalho experimental de síntese, procedeu-se paralelamente à validação do
equipamento pré-clínico de imagem FLEXTM TriumphTM micro-PET-SPECT-CT, recentemente
adquirido e instalado no C2TN-IST. O processo de validação envolveu duas fases, tendo-se iniciado com
a utilização de diversos fantomas, tais como tubos de Eppendorf e seringas contendo soluções
radioactivas. Este trabalho preparatório culminou numa segunda fase, na aquisição de uma imagem
SPECT-CT de ratinhos com tumor (Balb/c com xenotransplantes celulares PC-3 de adenocarcinomas
da próstata de origem humana) após administração localizada de nanopartículas radiomarcadas com
67Ga (
67Ga-AuNP-BBN-Pt1). Os resultados das imagens pré-clínicas adquiridas (figuras 4.25 e 4.26)
mostram uma diferença substancial na migração do composto 24 h p.i, que parece fixar-se durante um
longo período (> 24 h) no tumor.O trabalho descrito nesta dissertação, teve como objetivo a síntese de um péptido e a sua conjugação
a um agente quelante bifuncional, visando a sua marcação radioativa com 67Ga e posterior avaliação da
sua biodistribuição em ratinhos por imagiologia pré-clínica multimodal FLEXTM TriumphTM microPET-SPECT-CT. Em simultâneo, pretendeu-se validar e calibrar o equipamento pré-clínico multimodal
micro-PET-SPECT-CT recentemente adquirido pelo C
2TN-IST. Uma vez que não foi possível a
aquisição de imagens nucleares com radiopéptidos inicialmente propostos, em alternativa, e após
validação do equipamento, fez-se um estudo imagiológico de nanopartículas radiomarcadas com 67Ga
(
67Ga-AuNP-BBN-Pt1), em ratinhos Balb/c com xenotransplantes celulares PC-3 de adenocarcinomas
da próstata de origem humana.
Em conclusão, pode dizer-se que o trabalho experimental realizado contemplou a utilização de
inúmeras diferentes técnicas e metodologias, englobando diversos métodos de síntese peptídica em fase
sólida, purificação, técnicas de radiomarcação e muito mais. Adicionalmente, foram também realizadas
aquisições e tratamentos de imagens multimodais SPECT-CT de modelos animais. Esta abrangência
permitiu ao mestrando tomar contacto com muitos aspetos essenciais da Medicina Nuclear, mais
especificamente com os relacionados com a radioquímica farmacêutica e equipamento de imagiologia
pré-clínica
