Towards a democratization of the use of flow cytometry for diagnosis and monitoring of allergy

Abstract

L’allergie représente un problème majeur de santé public. Le test de provocation orale constitue l’étalon-or du diagnostic de l’allergie. Cependant, pouvant induire de graves réactions cliniques, il se réalise à l’hôpital. D’autre part, les tests cutanés et sérologiques permettent d’étudier le profil de sensibilisation d’un individu à des allergènes (présence d’IgE spécifiques). Ces approches nécessitent une interprétation rigoureuse et permettent d’orienter de diagnostic de l’allergie. Le test d’activation des basophiles (TAB) est un test cellulaire fonctionnel qui représente une approche unique en allergologie. Bien que sa pertinence et son utilité soient établies, du fait de limitations techniques, son utilisation reste limitée à des laboratoires spécialisés. Afin que toutes les capacités du TAB puissent être exploitées, une levée de ces limitations est indispensable. L’objectif de cette thèse a été de travailler à une amélioration technique du TAB. Nous avons simplifié la chaîne pré-analytique du TAB. L’approche développée utilise une innovation technologique (DURA Innovation, Beckman Coulter) permettant l’emploi de réactifs secs, stables à température ambiante et prêts à l’emploi. La méthode se fait sur du sang total, sans étape de lavage, ne nécessite que 4 étapes de pipetage et, malgré l’utilisation d’un cocktail d’anticorps de 5 couleurs, sans compensation lors de l’analyse au cytométre. La méthode développée a été mise en œuvre dans différentes études constituant le volet clinique de la thèse. Nous avons aussi démontré la possibilité de miniaturiser le TAB en le transposant au format plaque 96 puits avec une préparation des échantillons totalement automatisée.Allergy is a major public health issue. The oral provocation test is considered as the gold standard of allergy diagnoses. Nevertheless, it can induce severe clinical reaction and need to be performed inside an hospital facility. On the other hand, skin testing and serum quantification tests allow to study one’s sensibilisation profile to allergens (Specific IgE detected). These methods require meticulous interpretation and allow to guide the allergy diagnosis process.Basophil Activation Test (BAT) is a cellular functionnal test. By reproducing ex vivo allergic reaction, it represents a unique approach in allergology field. Even if the relevance and the utility of the BAT have already been established, the use of this test is currently limited to specialist laboratories. It is necessary to overcome some limitations of the BAT to fully leverage its capabilities.The main objective of this thesis was to work on technical improvements of BAT in flow cytometry. We simplified the whole pre-analytical workflow. The developped BAT procedure uses a technological innovation (DURA Innovation, Beckman Coulter) allowing to use dry reagents, stable at room temperature and ready to use. The process is done on whole blood, using 5 color compensation-free antibody panel, without washing step, and requires only four pipetting steps before cytometre analysis. This BAT method has been used for different studies during this thesis and constitues the clinical part of the study.In a second step, we wanted to go further into BAT process simplification. We demonstrated the possibility to miniaturize the BAT by transposing it to 96-well plate format with a fully automated sample preparation