Bucher, H.U.

Duc, G.

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Die Infrarot-Laserspektroskopie zur Messung von Cytochrom aa3H.U. Bucher, G. DucNeonatologie-Abteilung, Frauenklinik,Universitätsspital ZürichJöbsis und Mitarbeiter zeigten 1977, dass der Redox-Zustand von Cytochrom aa3, einem Schlüsselenzym desaeroben Stoffwechsels, mit der Infrarot-Spektroskopie inMyokard und Hirngewebe kontinuierlich gemessenwerden kann (1). Damit eröffneten sich neue Möglich-keiten zur Untersuchung der zellulären Hypoxie Essollen hier die Grundlagen dieser Methode, eine neue,hochempfindliche Apparatur und erste damitgesammelte klinische Erfahrungen beschrieben werden.Funktion des Cytochroms aa3Glukosel GlykolysePyruvatAtmungsketteIn Zellen mit hohem Energiebedarf ist der wichtigsteEnergieliferant die Atmungskette. Diese besteht auseiner Reihe von Enzymen an der inneren Membran derMitochondrien, die den Elektronenfluss vom Krebs-zyklus bis zum Sauerstoff katalysieren. Dieser Elektro-nentransport ist mit der Bildung von Adenosintriphos-phat (ATP) aus Adenosindiphosphat (ADP) und freiemPhoshat gekoppelt (oxidative Phosphorylierung) (2), Dasletzte Enzym in der Atmungskette ist das Cytochromaa3, von dem die Elektronen unmittelbar an denSauerstoff abgegeben werden. Ist zu wenig Sauerstoffvorhanden, so stauen sich die Elektronen undCytochrom aa3 liegt in reduzierter Form vor. In Organenmit hohem Energiebedarf, wie Herz, Leber, Nieren, Hirnund Muskulatur, ist die Konzentration von Cytochromaa3 besonders gross.Optische Eigenschaften von Cytochrom aa3Seit den 50er Jahren ist bekannt, dass die reduziertenFormen der Cytochrome zwischen 500 und 650 nmspezifische Absorptionsmaxima haben, die im oxidiertenZustand kleiner werden. Damit lassen sich bei Verwen-dung der geeigneten Wellenlängen im sichtbaren Be-reich die einzelnen Cytochrome spektrophotometrischvoneinander unterscheiden und ihr Redox-Zustandbestimmen. Dies ist jedoch nur in vitro und nicht in vivomöglich, da sichtbares Licht in durchblutetem Gewebestark abgeschwächt wird.Das Cytochrom aa3 besitzt im oxidierten Zustand einzusätzliches, allerdings relativ flaches Absorptions-maximum bei 830 nm. Daher kann neben oxidiertemund reduziertem Hämoglobin mit einemSpektrophotometer mit mindestens vier Wellenlängenim Infrarot-bereich in vivo gemessen werden.cient. mmo*SJion coe700 750 800 850wovelength. nm900 95Absorptionsspektren im Infrarotbereich von oxidiertem(—) und reduziertem (· · ·) Cytochrom aa3 (3)Biomedizinische Technik Band 35 · Ergänzungsband 1 47Apparatur zur Infrarot-Spektrophotometrievon Organen im DurchlichtDas hier beschriebene Gerät wurde von M. Cope und D.Delpy in London entwickelt und von der japanischenFirma Hamamatsu hergestellt (4). Sie enthält einenPhotonenzähler, der kleinste Lichtmengen bis zu einzel-nen Photonen registriert, und ist deshalb empfindlicherals ähnliche Vorrichtungen (5,6,7).Berechnung von Konzentrationsänderungenvon Cytochrom 883 in vivoDas Gesetz von Beer und Lambert formuliert die Bezie-hung zwischen Absorption und Konzentration einerSubstanz:Schema des NIR-1000 von Hamamatsul 1 Filier Conlrollpr l *,| Temp. ControllerPeltie Cooler j fl oibn^n-/^ Laser Diode!/ ( ''l Laser Diode 6L//ic 11\ ] Photodiode (Inc.)\^ Photodiode (Rel.)ExternalSignalInputs+—— .»·----— *.--f-MultichannelPhoton FCounlerLaser DiodeControllerSelector-A/D =0esC3n>-. .«,3JJ1CPUFDDKey-board\\s\t\\'F-Vo oExterna! TriggerMuitichannelDataAccumulatorSechs Laser-Dioden mit Wellenlängen zwischen 775 und905 nm werden mit einer Frequenz von 4 kHz sequen-tiell angeregt. Die Lichtstrahlen werden über einGlasfaserbündel zum Messobjekt, in unserem Fall meistein Kopf eines Neugeborenen, geführt. Auf der gegen-überliegenden Seite wird das durchgetretene Lichtaufgefangen und von einem zweiten Glasfaserbündelüber einen Filter in einen Photomultiplexer (PMT)t derauf 5 Grad gekühlt ist, geleitet. Das gefilterte und ver-stärkte Licht gelangt schliesslich in einen Photonen-zähler. Ein Computer steuert den ganzen Messvorgang,führt die Korrekturen für temperaturbedingte Aenderun-gen der Lichtintensität der einzelnen Laserdioden und fürStreulicht aus und berechnet die Konzentrationen desreduzierten und oxidierten Hämoglobins und desoxidierten Cytochroms 333.SicherheitDie Lichtintensität auf der Hautoberfläche ist eine Grös-senordnung unterhalb der nach lEC-Norm 825 erlaub-ten. Hingegen besteht die Gefahr einer Netzhautschädi-gung, wenn das ücht von vorne ins Auge fällt und durchdie Linse gebündelt wird. Aus diesem Grunde werdendie Laserdioden automatisch abgeschaltet, sobald dasreflektierte Signal deutlich abfällt, d.h. wenn der Kontaktzwischen Sender und Haut nicht mehr dicht ist.A AbsorptionIjn einfallende Lichtintensität>out austretende Lichtintensitäta Absorptionskoeffizientd optische Wegstreckec KonzentrationDiese Beziehung gilt für ideale Lösungen. Ihre Anwen-dung für Messungen in Organen bedarf einiger Annah-men und Modifikationen.1. Infrarotlicht nimmt im durchbluteten Gewebe pro cmetwa eine Zehnerpotenz an Intensität ab. Davon sind nuretwa 7% durch die Absorption des Cytochroms 333 undetwa 10% durch Absorption des Hämoglobins bedingt(4).Spektrophotometrische Messungen von Konzentra-tionsveränderungen sind also nur möglich, wenn manannimmt, dass der übrige Intensitätsabfdll konstant ist.Mindestens für Hirn, Haut und Knochen dürfte dieseAnnahme zutreffen, für Muskelgewebe ist sie fraglichwegen des Myoglobins.2. Um Cytochrom 333 vom oxidierten und reduziertenHämoglobin unterscheiden zu können, müssen min-destens vier verschiedene Wellenlängen verwendetwerden (8).3. Die Absorptionskoeffizienten für Hämoglobin wurdenin hämolysiertem und mit 100% Ssuerstoff oder 100%Stickstoff tonometriertem Blut bestimmt. Cytochrom 333verändert sein Absorptionsspektrum, wenn es aus denZellen herausgelöst und gereinigt wird. Sein Absorp-tionskoeffizient muss deshalb in vivo in Abwesenheit desinterferierenden Hämoglobins bestimmt werden. Wrayund Mitarbeiter haben dieses Problem gelöst, indem siebei Ratten das Blut durch Fluorocarbon, einen nichtabsorbierenden Sauerstoffträger, ersetzten, und danndas Absorptionsspektrum des Hirnes in Hypoxie undNormoxie ermittelten (8).4. Der optische Weg, den das Infrarotlicht im Gewebezurücklegt, ist wegen der starken Streuung länger als diekürzeste Distanz zwischen Eintritt und Austritt. Für dssHirn von Frühgeborenen wurde mit zwei verschie-denenMethoden ein Korrekturfsktor von 4,3 ermittelt (8,9). Fürgrössere Kinder und Erwachsene und für andereGewebe ist dieser Muftiplikationsfaktor neu zubestimmen.48 Biomedizinische Technik Band 35 · Ergänzungsband 1Klinische Erfahrungen bei NeugeborenenDie Infrarot-Spektroskopie wurde bisher vor allem beiNeugeborenen in Intensivpflege angewandt (10,11). Diein der Schlägengegend mit einer elastischen Binde be-festigten Lichtleiter werden von den Kindern in der Re-gel während mehreren Stunden gut toleriert. Problemekönnen auftreten, wenn ein Kind den Kopf heftig be-wegtund die Lichtleiter verrutschen. Dies ist jedoch beiKindern, die maschinell beatmet und sediert oder cura-risiert sind, kau m der Fall.160HO-120-100-8060-40-Apnoe Apnoe 5 MinutenAufzeichnung bei einem Frühgeborenen während zweispontanen Apnoen. Während der Atemstillstände fälltder transcutane Sauerstoffpartialdruck (tcP02) und mitVerzögerung die Herzfrequenz (HF) und das oxidierteCytochrom aa$ im Hirn (Cyt 333) ab. Der transcutaneKohlensäurepartialdruck (tcPCC^) steigt an und dascerebrale Blutvolumen (cBV«Summe des oxidierten unddes reduzierten Hämoglobins) steigt nach einem initia-len Abfall stark an. Alle erfassten Grossen kehren nachdem Ende der Apnoe wieder in den Ausgangsbereichzurück.Aehnliche reversible Abfälle des oxigenierten Cyto-chroms aa3 wurden bei Hypoxämien während Krämpfenoder während intratrachealen Absaugens beobachtet.SchlussfolgerungMit einem hochempfindlichen Laser-Spektrophotometerkönnen bei Neugeborenen während kurzzeitigenHypoxämien reversible Abfälle des oxidierten Cyto-chroms 333 im Hirn nachgewiesen werden. Es bedarfnoch weiterer Grundlagenforschung, um diese Abfällequ3ntifizieren und lokalisieren zu können. Dazu muss inklinischen Studien die Bedeutung solcher Konzentra-tionsschwankungen ermittelt werden, indem diese zuanderen Messgrössen (z.B.zum arteriellen Sauerstoff-psrti3ldruck) und zur psychomotorischen Entwicklungder Kinder in Beziehung gesetzt werden.Referenzen1. Jöbsis FF, Keizer JH, LaManna JC, Rosenthal M:Reflectance spectrophotometry of cytochrome 333 invivo. J Appl Physiol 1977; 43:858-8722. Lehninger AL: Bioenergetics. 2nd ed, Benjamin,New York, 19733. Brunori M, Antonini E, Wilson MT: Metsl ions in biolo-gicsl Systems XXIII. Msrcel Dekker, New York 1981:187-2284. Cope M, Delpy DT: System for long-term measure-ment of cerebral blood and tissue oxygenation onnewborn infsnts by nesr infrs-red transillumination.Med & Biol Eng & Comput 1988; 26:289-2945. Jöbsis FF: Nonivssive, infrared monitoring ofcerebral and myocardial oxygen sufficiency andcirculstory psrameters. Science 1977; 198:1264-12676. 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