Bay., U.

Hensel, M.-C

Huber, A.

Lehmann, K.

Müller-Glauser, W.

Turina, M.

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Gewinnung funktionsfähigerEndothelzellen aus VenenA, Huber, U. Bay, W. Müller-Glauser*, MXX Mensel*, K. Lehmann*. M. Turina*Gebrüder Sulzer AG, Medizinaltechnik, Winterthur•Klinik für HerzgefäBchirurgie, Universitätsspital Zürich,E I N L E I T U N GDie Grenze zwischen Blut und Gefäss-wand wird vom Endothel gebildet. Dieses Ge-webe, das aus nur einer Schicht von Zellen,den Endothelzellen, besteht, kleidet dieBlutgefässe lückenlos aus. Durch ihre Akti-vität verhindern die Endothelzellen, dassdas Blut gerinnt. Dagegen verschliessenBlutgerinnsel Prothesen aus alloplastischenMaterialien in hohem Prozentsatz, wenn derInnendurchmesser weniger als 6 bis 8 mmbeträgt. Deshalb ist der Ersatz kleinerArterien bei fehlenden oder unbrauchbarenVenen noch immer ein ungelöstes Problem derChirurgie.Um bei kleinlumigen Gefässprotheseneine antithrombogene Oberfläche zu erhalten,wird versucht, sie mit autologen, d.h. pati-enteneigenen Endothelzellen zu versehen( 1 , 2 , 5 ) . Dafür werden reine Populationenfunktionsfähiger Endothelzellen benötigt.Ziel dieser Untersuchung war es, einRoutineverfahren zur enzymatischen Isolationvon reinen Populationen venöser Endothel-zellen zu entwickeln, und die notwendigenApparate für eine automatisierte Durch-führung zu bauen.M E T H O D EE n t n a h m e und L a g e r u n g de r VeneAlle Präparätionsschritte erfolgen un-ter streng aseptischen Bedingungen mit ste-rilen Instrumenten. Ein Venenstück wird nachchirurgischen Standardmethoden entnommen, ·mit Kulturmedium (6) gespült und beidseitigkanüliert. Es wird im Venenhalter ( 7 ) mon-tiert (Abb. 1), so dass es etwa 80 % seinerin situ Länge hat ( 4 ) . Dann wird der Halterdurch einen Glaszylinder gasdicht geschlos-sen und der Raum zwischen Zylinder und Venemit'physiologischer Salzlösung gefüllt. DasLumen der Vene wird mit Kulturmedium aus-gespült und anschliessend für Transport undLagerung mit frischem Kulturmedium gefüllt.Abb. 1: Venenhalter. Beidseitig kanülierteVene im Halter montiert; auf der linken Sei- ] ; ?te Spritzen zum Spülen und FüllenGewinnung der Endothelzel len /Die Endothelzellen werden mit dem Ven-enhalter in einem neuentwickelten Apparat '.(Abb. 2) automatisch isoliert. Dem,Verfahrenliegt eine enzymatische Ablösung der Zellenvon der Gefässwand zugrunde. Während desganzen Vorgangs wird darauf geachtet,, dass.die Vene nie kollabiert oder überdehnt; wird.Im folgenden werden die einzelnen Phasen derZellgewinnung kurz beschrieben (Abb. 3). . ,1. Das Kulturmedium wird mit physiologi-scher Pufferlösung (3) ausgespült, .2. Die Vene wird mit Enzymlösung von 37°Cgefüllt (3) . . . , ; . ,.. . ;3. Die innere Oberfläche der Vene bleibtbei 37° C während der Inkubationszeit ..mit der Enzymlösung in Kontakt,. .. .4. Dabei wird die Enzymlösung in.regelmässi-gen Abständen gegen frische ausgetauscht.5. Die Vene wird mit Pufferlösung ( 3 ) . v o n . ~ -„. 4°c sanft gespült. , ; , , r . > %6. Die Vene wird kräftig gespült. Die Zellen.werden im Zellabscheidefilter zurückge-.,-· - halten, während die Enzymlösung mit-der V'Spüllösung durch das Filter abfliesst. ','7. Die gespülten Zellen werden durch einekräftige Strömung mit Kulturmedium von4°C in den Vermehrungsreaktor zur.Anzucht transferiert.• • S ;189 Biomedizinische Technik Band 33 : Ergänzungsband 2Abb. 2: Automatischer Apparat mit eingesetz-tem Venenhalter, i RESULTATE·! Die Druck- und Flusswerte, die in der•Vene während der Zellgewinnung auftreten,sind in ihrem zeitlichen Verlauf in Abbil-jdung 3 dargestellt. Die Inkubationsphase ist;in dieser Darstellung zeitlich stärker ge-raff t als die übrigen Phasen. Der Druck warnur beim kräftigen Ausspülen der Zellen.(Phase 6) kurzzeitig leicht hyperton (140mrnHg) , d.h. etwas höher als der normalearterielle systolische Blutdruck.Die Anfärbung (Trypanblau) der Venen-innenseite nach der Isolation zeigte, dassregelmässig über 95 % der Endothelzellen vonder Venenwand abgelöst worden waren. DieseBeobachtung wurde durch rasterelektronen-mikroskopische Untersuchungen bestätigt.Die Reinheit der Endothelzellpopula-tionen wurde an Kulturen durch spezifischeMarkierung der Zellen für das Faktor VIII-related Antigen (3) und durch DilAcLDL-Auf-nahme (8) nachgewiesen.Abb. 3: Druck- und Flußsverlauf bei einerautomatischen Isolation von Endothelzellenaus einer Vene mit 4 mm InnendurchmesserDie Funktionsfähigkeit der Endothel-zellen wurde durch Implantation beschichte-ter Prothesen in -den arteriellen Kreislaufvon Hunden gezeigt ( 5 ) und auch durch Mes-sung der Prostacyclinproduktion nachge-wiesen ( 5 ) .D I S K U S S I O NMit den beiden neuen Geräten, demVenenhalter und der Automatik dazu, die hierbeschrieben werden, können reine Populatio-nen von Endothelzellen aus Venen routine-mässig gewonnen werden.Der Venenhalter schützt die Vene wäh-rend Transport und Lagerung vor Austrocknungund mikrobieller Kontamination. Auch bei derIsolation ermöglicht er eine schonende unddefinierte Halterung der Vene. Das verhin-dert Verletzungen der Endothelzellschicht.Es werden darum keine anderen Zelltypen alsEndothelzellen isoliert, so dass man Zell-populationen erhält, deren Reinheit denAnforderungen für die Prothesenbeschichtunggenügt.Für die Durchführung von grösseren Ver-suchsserien und vor allem für den späterenklinischen Einsatz ist eine Automatisierungder Endothezellgewinnung unumgänglich. Fürdiese Anwendungen wurde die Automatik ·gebaut.Das neue, automatische Verfahren reali-siert sowohl die Qualitätsanforderungen be-züglich Reinheit der Endothelzellpopulatio-nen als auch die Forderung nach eff izienterDurchführung der Zellgewinnung im Routine-einsatz.L I T E R A T U R(1) Herring M, Gardner A, Glover J: ·A single-staged technique for seeding vas-cular grafts with autogenous endothelium.Surgery ££: 498-504, 1978.(2) Herring MB, Compton RS, LeGrandDR, Gardner AL, Madison DL, Glover JL:Endothelial seeding of polytetrafluoro-ethylene popliteal bypasses. J Vase Surg 6:114-118, 1987.(3) Ja f fe EA: Culture of human endo-thelial cells. Transplant Proc 12_ N o . 3 ,Suppl. l: 49-53, 1980.(4) Lehmann KH, Müller-Glauser w, EayU, Turina M: Harvesting of highly purifiedcanine venous endothelial cells for liningof small diameter vascular prostheses. EurSurg Res 2£ Suppl l: l, 1988.(5) Müller-Glauser W, Lehmann KH,Bittmann P, Bay U, Dittes P, von Segesser L,Turina M: Compliant small-diameter vascularprosthesis lined with funct ional venousendothelial cells. Trans Am Soc Artif IntOrgans ( in press)(6) Thornton SC, Muel ler SN, LevineEM: Human endothelial cells: use of hepai'inin cloning and long-term senal cul t iva t ion .Science 222: 623-625 ( 1 9 8 3 ) .(7) Venenhalter (Patent angemeldet)(8) Voyta JC, Via DP, But te r f i e ld CE,Zetter BR: Ident i f icat ion and isolation o*endothelial cells based on their increaseduptake of acetylated-low density lipopro-tein, J Cell Biol 99: 2034-2040 . 1984.Blomedlzin!echeTbchnikBand33 · Ergänzungsband 2 190

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