Böni, P.

Kurrat, R.

Ramsden, J.J.

Spencer, N.D.

Textor, M.

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Adsorption von Biomolekülen an planaren optischen WaveguidesKurrat R., Textor M., Ramsden J.J.1, Spencer N.D., Böni P.2Laboratory for Surface Science and Technology,Department of Materials, Zürich, CH-8092 Zürich1 Department of Biophysical Chemistry,Biocenter of the University, CH-4056 Basel2 Paul Scherrer Institut, CH-5232 Villigen PSIEINLEITUNG:Titan ist wegen seiner exzellenten Biokompatibilität einweit verbreitetes Implantmaterial. In Kontakt mit derbiologischen Umgebung adsorbieren an der OberflächeBiomoleküle, z.B. Proteine, die das weitere Verhalten desImplantats im Körper entscheidend beeinflussen. Daherist es wichtig, die entsprechenden Oberflächenprozessegenau zu kennen [1].Die Methode der Optical Waveguide LightmodeSpectroscopy' (OWLS) ist für kinetische Untersuchungenvon Adsorptionsprozessen an Oberflächen von Wavegui-des sehr geeignet, z.B. Adsorption von Proteinen [2,3]oder Zellen [4]. Um möglichst gezielt die Oberflächenei-genschaften von Titanimplantaten nachzustellen, wurdendie Waveguide Oberflächen mit Titanoxid (TiO2) mittelsPVD (thermische Verdampfung) und Magnetron Sputte-ring beschichtet.METHODE:Die OWLS Methode basiert auf dem Prinzip der Totalre-flexion von Licht in Medien mit hohem Brechungsindex[5]. Figur l zeigt den schematischen Aufbau der Appara-tur:Protein/Puffer - Lösung- · ·ProteinmoleküleTiSiO,Photo-diodeLaserstrahlTrägermaterial GlasFigur 1: Schematische Darstellung des OWLS Prinzips.Der von unten kommende Laserstrahl wird dabei mitHilfe eines Beugungsgitters in die hochbrechende Schicht(Mischung aus Si02 und TiO2) eingekoppelt und durchTotalreflexion bis zum Ende des Waveguides geführt, woer anschließend von Photodioden aufgefangen wird. Diegeführte Welle dringt dabei in einem Bereich von ca.lOOnm in die Flüssigphase der Adsorptionszelle ein(evanessent wave) und tritt dabei in Wechselwirkung mitden an der Oberfläche befindlichen Molekülen (z.B.Proteine oder Zellen). In sehr dünnen Schichten (hier 150bis 180 nm) kann das Licht nur in diskreten Modengeführt werden. Um den effektiven Brechungsindex nachGleichung (1) zu bestimmen wird daher der Winkel a,mit dem der Laserstrahl auf das Beugungsgitter trifft,variiert.N = nair-sina +-(1)l- Beugungsordnung= Wellenlänge Laser = 632.816 nm= Gitterperiode = 416.15 nmDaraus läßt sich dann anschließend die Masse der adsor-bierten Proteine berechnen [6,7].ARBEITEN und ERGEBNISSE:Die Messungen wurden an einem kommerziellen Instru-ment der Firma Artificial Sensing Instruments (ASI,Zürich) durchgeführt. Da die von diesem Gerät verwen-deten Waveguides zu groß für ergänzendeUntersuchungen mittels XPS, ToF-SIMS oder AFM sind,mußte zunächst eine Halterung für kleinere Waveguideshergestellt werden. Diese besteht aus einem Einsatz,welcher die Verbindung zu den Photodioden mittelszweier Lichtleiter Bündel aufrecht erhält. Dank derkleinen (8x12mm) Waveguides können nun z.B. XPSMessungen vor und nach einem OWLS Versuch gemachtwerden. Dabei zeigte sich, das die verwendete SiliconFließzelle eine hohe Kontamination der WaveguideOberfläche zur Folge hatte. Abhilfe konnte hier durch dieVerwendung einer Fließzelle aus Kalrez® (Dupond)geschaffen werden.Titan Implantate besitzen auf ihrer Oberfläche immer einenatürliche Oxidschicht. Um nun die Oberfläche von TitanImplantaten möglichst gut zu simulieren, wurden dieWaveguides mit einer zusätzlichen TiO2 Schicht verse-hen. Durch den hohen Brechungsindex des Ti02 werdendabei die Einkopplungswinkel zu größeren Winkelnverschoben; ab einer gewissen Schichtdicke liegen sieaußerhalb des verfügbaren Meßbereichs (Figur 2). EineBeschichtungsdicke von 10 nm erwies sich als genügenddünn bzgl. Meßbereich und gleichzeitig genügend dickbzgl. Ausbildung einer geschlossenen Oberflächenschicht.418 Biomedizinische Technik · Band 41 · Ergänzungsband 1 · 1996Fig. 3 und 4 zeigen XPS Spektra der Waveguide Oberflä-che vor und nach der TiO2 Beschichtung. Das völligeVerschwinden der Silizium Peaks zeigt, das die Schichtdas Substrat vollständig bedeckt.LEFT photodetector spectrum100Eta [%JTMpeak10 nm coatedo Ideg]Figur 2: Gemessene Einkopplungswinkel mit und ohnezusätzlicher TiO2 Beschichtung.XPS uncoated waveguide160-120-l-M·c£c40-O(KLL) O (1s)Ti(2p)Si(2s)C(1S) l SW-*L-800 600 400Bmding Energy {*VJ200 Tl (3S)Figur 2: XPS Spektrum - unbeschichteter Waveguide.XPS ASI1400 with 10nm TiO2 coating200-150-> 100-50-O (1s)Ti(2p)C(1 s) T. PP)1000 800 600 400 200Binding Energy [eVJFigur 3: XPS Spektrum - mit lOnm TiO2 Beschichtung.Für die Adsorptionsexperimente wird die Durchflußzellemit der zu untersuchenden Lösung (z.B. Proteine inPufferlösung) beschickt. Das Gerät liefert als Ergebnisden Verlauf der adsorbierten Masse mit einer Zeitauflö-sung von typisch 3 s. Die Nachweisgrenze Hegt bei ca. lng/cm2.Figur 4 zeigt als Beispiel die Adsorption von HumanSerum Albumin (HSA) auf einem TiO2 beschichtetenWaveguide. Nach der anfanglichen Spülphase mit reinemPuffer (Konditionierung), folgt die Adsorption aus derProtein/Puffer Lösung. Anschließend wird ein Teil desProteins beim zweiten Spülvorgang wieder von derOberfläche entfernt. Dies deutet darauf hin, das es zweiverschiedene Adsorptionszustände des Proteins gibt: einreversibler und ein irreversibler. In Fig. 4 sind neben denexperimentellen Daten auch die Ergebnisse der kineti-schen Modellierung auf Basis eines Adsorptionsmodellsmit reversibler und irreversibler Komponente dargestellt.Adsorption of HSA onto ASI1400OJ»0300.1»0.10o.oso.ool» (UKvtMxQ l·«.!!«, bou~J11X80Figur 4: Human Serum Albumin aufTiO2 WaveguideDie Summenkurve der beiden Zustände beschreibt dabeidie experimentellen Daten sehr gut [3].Weiterhin ist es mit gewissen Einschränkungen auchmöglich, Zell-Adhäsion und -Ausbreitung (Spreading) zumessen. Da die Dimensionen der Zellen weit über denMeßbereich hinausgehen wird nur der grenzflächennaheTeil der adsorbierten Zelle erfaßt. Unter der Annahme dasin einer ersten Phase keinerlei Ausbreitung der Zellenstattfindet, kann die Anzahl der angelagerten Zellenbestimmt werden. Sofern in der zweiten Phase keineweiteren Zellen hinzu kommen (gestoppter Fluß) kann dieAusbreitung der Zellen auf der Oberfläche durch denAnstieg des Signals verfolgt werden.Derzeit im Gange ist ein Vergleich von OWLS mit derQuarz Crystal Microbalance (QCM) und mit in situEllipsometrie, um detaillierte Aussagen über die Genau-igkeit und Nachweisempfindlichkeit der Methodenmachen zu können.SCHLUSSFOLGERUNGEN:Die Optical Waveguide Lightmode Spectroscopy(OWLS) ist ein geeignetes Instrument für die Bestim-mung der Adsorptionskinetik von Biomolekülen anOberflächen mit hoher Empfindlichkeit und Zeitauflö-sung. Durch Beschichtung der Waveguide Oberfläche mitsehr dünnen Schichten kann der Einfluß der Oberflächen-chemie studiert werden. Mittels lOnm TiO2Sputterschichten lassen sich z.B. die Oberflächen vonTitanimplantaten simulieren.LITERATUR:[1] B.D.Ratner, 1993, J. Biomed. Mat. Res., 27, 837[2] J.J.Ramsden, 1993, Phys. Rev. Lelt., 71,295[3] R.Kurrat, J.J.Ramsden, J.E.Prenosil, 1994, J. Chem.Soc.: Faraday Transactions, 90 4, 587[4] JJ.Ramsden, S.Y.Li, E.HeinzIe, J.E.Prenosil, 1995,Cytometry, 19 2, 97[5] J.J.Ramsden, 1993, J. Stat. Phys., 73 5/6, 583[6] W.Lukosz, KTiefenthaler, 1983, Opt. Leu., 8, 537[7] K.Tiefenthaler, W.Lukosz, 1989, J. Opt. Soc. Am. B,6,209Biomedizinische Technik · Band 41 · Ergänzungsband 1 · 1996 419

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