L. Defilippi

L. Rustioni

M. Rossoni

O. Failla

AIR Universita degli studi di Milano

Acta Italus Hortus 3: 235-239235Development of a new phenolicripening index based on seed oxi-dationAbstract. In spite of the increasing in chemical andphysiological knowledge, the observation of the seedbrowning is still the best method to evaluate the grapephenolic ripening, even though it is a subjective indi-cator. A number of results are in agreement with thehypothesis of the seed phenolics oxidation as animportant interpretative key of tannin change duringripening. The aim of this work, is to study the seedmaturation, with the objective of develop a new indexbased on phenolic oxidation and useful for wine busi-ness. With this purpose, we tested different spec-trophotometric assays. We analyzed Pinot noir andCroatina from Oltrepò pavese (Italy), sampled in2009. Two indexes were developed: one related tothe molecular structure, and the other concerning theantioxidant activity. Both the indexes were significant-ly correlated with the ripening time and with the seedcolor change. Considering the differences betweenthe two cultivars, an important result was the similarresponse which allowed to consider the samplestogether. As expected, the structural index decreasedduring ripening, indicating molecular changes relatedwith phenolic oxidation. Contrarily, and unexpectedly,the antioxidant index increased during ripening. Aninteresting negative correlation was found betweenthe two indexes. Comparing HPLC chromatograms,we found epicatechin-3-O-gallate as the flavan-3-olwhich showed the biggest decrease.Key words: grapes, poliphenols, quality, tannins,Vitis vinifera.Introduzione“…Naturalis autem maturitas est, si cum expres-seris vinacea, quae acinis celantur, iam infuscata etnonnulla praeter modum nigra fuerint. Nam coloremnulla res vinaceis potest adferre nisi naturae maturi-tas...” nella sua “De Re Rustica” Columella (4-70D.C.), ha indicato il cambiamento del colore dei semicome il miglior indice di maturazione. Attraverso isecoli, Kennedy et al. nel 2000 hanno descritto ilcambiamento visivo del colore dei semi durante lamaturazione e Ristic et al. hanno pubblicato, nel2005, una carta colorimetrica. Due secoli di coltiva-zione dell’uva e produzione del vino hanno sottoli-neato l’importanza di questo fenomeno sulla qualitàdel prodotto finito. Nonostante la sua importanza e l’incremento nelleconoscenze chimiche e fisiologiche, l’osservazionedell’imbrunimento del seme rimane il miglior metodoper valutare la maturazione fenolica dell’uva, anchese si tratta di un indicatore soggettivo, e non è facilediscriminare le tonalità di marrone per la mancanza diomogeneità tra i semi e nello stesso seme, anche inrelazione alla similitudine dei colori negli ultimi stepsdella maturazione (i più importanti ai fini produttivi).Fino a poco tempo fa, si credeva che il cambia-mento nel colore fosse dovuto alla lignificazione deitegumenti del seme, e che i fenoli dei semi diminuis-sero come conseguenza di una barriera fisica contro laloro estrazione (Ribéreau-Gayon et al., 1998).L’indurimento dei semi è però dovuto alla lignifica-zione degli strati interni dei tegumenti esterni (Risticet al., 2005), mentre i tannini si trovano nel parenchi-ma molle del seme, tra la cuticola ed il rivestimentoduro (Adams, 2006). Questa evidenza diminuiscel’importanza della lignificazione ai fini enologici.Le auxine, l’etilene e la luce sono i principali sti-moli che influenzano lo sviluppo della bacca. Pilati etal. (2007) osservarono inoltre uno scoppio ossidativocaratterizzato da un rapido accumulo di H2O2ininvaiatura e dalla modulazione dei principali enzimidella via dei ROS. L’ossidazione dei fenoli può anchespiegare alcuni risultati relative al rendimento dellacatalisi acida in presenza di floroglucinolo. In unostudio iniziale sul metodo, riguardante l’evoluzionedelle proantocianidine in vinaccioli di Shiraz, il rendi-mento variava consistentemente in relazione allamaturità del frutto. Per le proantocianidine isolate apre-invaiatura la resa media era del 89%, dopo l’in-vaiatura questa diminuiva progressivamente per arri-vare a valori inferiori al 69% alla maturità commer-ciale. Questa osservazione, insieme ad altre (cambinella composizione dei flavan-3-oli monomeri,Sviluppo di un nuovo indice di maturità fenolica basato sull’ossidazionedei vinaccioliLaura Rustioni*, Mara Rossoni, Luigi Defilippi e Osvaldo Failla Dipartimento di Produzione Vegetale, Università di Milano*laura.rustioni@unimi.itRustioni et al.236aumento nei radicali organici liberi e cambiamentodel colore esterno del seme) suggeriscono che leproantocianidine siano ossidate dopo l’invaiatura(Kennedy e Jones, 2001).I tannini sono molto importanti nella qualità deivini rossi. Il loro impatto sensoriale cambia durante lamaturazione, ma questo non è legato a particolarifenomeni di accumulo o degradazione. Solitamente itecnici del settore utilizzano il contenuto antocianicoper valutare la maturità fenolica, ma osservando la viabiosintetica si può notare una specie di competizionetra la sintesi dei pigmenti e quella dei flavan-3-oli(considerati come sub unità formanti i tannini).Obiettivo di questo lavoro è quindi quello di svi-luppare un nuovo indice di maturità dei vinacciolirelativo all’ossidazione delle molecole fenoliche, uti-lizzando semplici e veloci metodi spettrofotometrici.Materiali e metodiUn primo piano sperimentale è stato svolto nel2008, dimostrando l’importanza dell’estrazione: deveessere svolta su semi freschi e solo gli estratti possonoessere successivamente conservati a basse temperature.Nel 2009 abbiamo lavorato su due varietà coltiva-te nel centro sperimentale di Riccagioia (TorrazzaCoste, Oltrepò Pavese): Pinot Nero e Merlot.Iniziando dalla chiusura del grappolo, i campionivenivano raccolti settimanalmente, in tre replichebiologiche.A causa delle differenze del numero medio di semiper bacca, ogni replica è stata ottenuta estraendo isemi contenuti in 20 acini di Merlot o 15 bacche diPinot nero. Prima dell’estrazione gli acini ed i semisono stati pesati, ed i semi sono stati contati. Il coloremedio dei semi è stato ottenuto usando la carta colori-metrica di Ristic et al. (2005). È stata fatta una doppiaestrazione con metanolo puro, per avere una buonasolubilità senza modificare le proprietà antiossidanti. Isemi raccolti sono stati quindi estratti prima in 25 mldi metanolo per 20 ore, e successivamente per altre 4ore in altri 25 ml di metanolo nuovo. Alla fine i dueestratti sono stati mischiati, per ottenere 50 ml totali.Diversi metodi sono stati testati, per svilupparenuovi indici relativi all’ossidazione delle molecolefenoliche: il contenuto in polifenoli totali (Di Stefanoet al., 1989), l’indice di proantocianidine per catalisiacida (Makkar, 2000), l’assorbanza a 280 nm, la rea-zione con DPPH (Siddhuraju e Becker, 2003; Aqil etal., 2006), la quantificazione dei sostituenti orto-dii-drossilati (Duran et al., 1991). Questi risultati sonostati misurati usando uno spettrofotometro Jasco 7800.Alla fine quattro estratti per ogni varietà sonostati selezionati per studiare i cambiamenti nellacomposizione fenolica, secondo i metodi diKammerer et al. (2004) e Monagas et al. (2005). Leanalisi sono state eseguite con un HPLC ShimadzuLC-10 AD VP (Shimadzu Co. Tokyo, Giappone)usando una colonna Nova-Pak C18 con precolonnaSecurityGuard (300 mm, 3,9 mm, 4 µm). Il flusso èstato impostato a 0,8 ml/min.Risultati e discussioneLa figura 1 mostra i cambiamenti del colore inrelazione alla carta colorimetrica di Ristic et al.(2005). Un importante cambio di colore è stato evi-denziato appena dopo l’invaiatura, quando i semi daverdi diventavano giallo/marroni.Il problema principale riscontrato con questometodo era la soggettività e la difficoltà nella classifi-cazione dei semi marroni. Comunque è stata rilevatauna buona correlazione tra il cambiamento di coloredei semi e la data di campionamento (fig. 2).Un obiettivo del nostro lavoro era lo sviluppo diFig. 1 - Cambiamenti del colore del seme in relazione alla cartacolorimetrica di Ristic et al. (2005).Fig. 1 - Seed color change obtained by the Ristic et al. (2005)color chart.Fig. 2 - Regressione lineare tra cambiamento di colore dei semi edata di campionamento (R2 = 0,811; y = 0,0615 * x + -8,453).  Fig. 2 - Linear regression of the seed color index  in relation tothe day of the year (R2 = 0.811;  y = 0,0615 * x + -8,453).Sessione II 237un indice utilizzabile per cultivar differenti. Dovrebbequindi rappresentare la qualità dei polifenoli dei semi,di conseguenza abbiamo deciso di “pulire” il risultatoutilizzando un rapporto, anziché un’indicazione diret-ta del contenuto.La tabella 1 indica la correlazione dei differentiindici proposti, e, considerando le performances delledue varietà ed il significato chimico, ne sono statiselezionati due:un indice di struttura molecolare dato dal rapporto•tra i sostituenti orto-difenolici e le proantocianidi-ne per catalisi acida;un indice delle proprietà antiossidanti ottenuto dal•rapporto DPPH/assorbanza a 280 nm.Per sviluppare gli indici chimici, sono state seguitestrade differenti.Abbiamo provato ad evidenziare i cambiamentinella struttura dei tannini (indice di struttura), in rela-zione alle proprietà dei diversi legami nei polimeritannici. Un metodo classico per la valutazione dei tan-nini è l’indice di proantocianidine: per catalisi acida,le unità di estensione unite da legami C4-C8 o C4-C6sono convertite in antociani colorati (Xie e Dixon,2005; Dixon et al., 2005). D’altra parte, è dimostratoche le sostituzioni orto-diidrossilate sono i migliorisiti per l’ossidazione nelle molecole di flavonoidi(Waterhouse e Laurie, 2006; Ribéreau-Gayon et al.,1998; Castañeda-Ovando et al., 2009). Per questaragione, abbiamo usato l’abilità di complessazione diquesti gruppi fenolici con alcuni metalli per avereun’indicazione della quantità di gruppi catecolo impe-gnati in legami prodotti dall’ossidazione. Il metodoproposto da Maestro Durán et al. (1991) utilizza leproprietà complessanti del molibdeno.La figura 3 mostra il trend dell’indice di strutturadurante lo sviluppo del seme. Il primo incremento puòessere legato ad una sintesi di tannini, mentre il decre-mento successivo potrebbe essere dovuto all’ossida-zione dei fenoli. L’altro punto di vista considerato è relativo alleproprietà antiossidanti.Poiché il reattivo di Folin-Ciocalteau (contenuto inpolifenoli totali) è anche associato con alle caratteri-stiche ossidative dei fenoli, abbiamo deciso di correla-re l’indice DPPH all’assorbanza a 280 nm. Le figure 4e 5 indicano la regressione lineare di questo indice inrelazione al cambiamento di colore dei semi e alladata di campionamento.Contrariamente alle nostre aspettative, l’indiceantiossidante aumentava progressivamente durante losviluppo del seme.Un correlazione negativa significativa è stataanche osservata tra i nostri due indici (Pinot nero, r =-0,547 e Merlot r = -0,581 entrambe con P < 0,001).Questo teoricamente significa che i prodotti di ossida-zione sono più antiossidanti dei loro precursori.Provando a spiegare questi risultati, abbiamo preso inconsiderazione le proprietà antiossidanti dei compostifenolici. Quando un fenolo reagisce con un ROS, lavelocità di reazione di ciascuna molecola fenolicadipende dalla sua abilità a formare prodotti radicalicirelativamente stabili.I composti contenenti un gruppo 1,2,3-triidrossili-co (pirogallolo), un anello aromatico 1,2-idrossilico(catecolo), o un anello aromatico 1,4.diidrossilico(assente nel vino) sono più facilmente ossidabili per-ché il radicale semichinonico fenoxile risultante puòessere stabilizzato da un secondo atomo di ossigeno(Waterhouse e Laurie, 2006; Ribéreau-Gayon et al.,1998; Castañeda-Ovando et al., 2009).La figura 6 mostra un esempio di prodotto di ossi-dazione di una proantocianidina (Allen, 1998). Inquesto caso la stabilizzazione degli intermedi è dovu-ta all’elevata delocalizzazione (fig.7).Con questo punto di vista è possibile supporre chei prodotti di ossidazione possono essere più antiossi-danti dei loro precursori.Parametri Pinot nero Merlotnorto-difenoli / polifenoli totaliorto-difenoli / assorbanza 280nmorto-difenoli / proantocianidineorto-difenoli / polifenoli totaliorto-difenoli / assorbanza 280nmorto-difenoli / proantocianidine24-0,551 **-0,191 ns-0,511 *0,122 ns0,742 **-0,095 ns33-0,084 ns0,042 ns-0,742 **0,536 **0,779 **-0,594 **Tab. 1 - Correlazioni tra l’indice di colorazione del seme e gliindici spettrofotometrici testati: considerando entrambe le varietà,i migliori indici sono risultati Orto-difenoli/proantocianidinecome indice strutturale e DPPH/assorbanza a 280 nm come indicedelle proprietà antiossidantiTab. 1 - Pearson correlations between the seed color index andthe tested spectrophotometric indexes. Considering both the vari-eties, the best indexes were: ortho-dihydroxylated/proanthocyani-din as structural inedex and DPPH/280 absorbance for theantioxidant properties.Fig. 3 - Trend  dell’indice di struttura durante losviluppo del seme. Fig. 3 - Structural index during seed development.Rustioni et al.238Infine abbiamo selezionato 4 campioni per ognivarietà rappresentativi del trend dell’indice. Dopoanalisi HPLC, abbiamo trovato che il cambiamentoprincipale nella composizione polifenolica era relativoalla diminuzione dell’epicatechina-3-O-gallato, inaccordo con Kennedy et al. (2000) che trovavano undecremento di epicatechina-3-O-gallato dall’8%all’invaiatura all’1% al momento della raccolta.ConclusioniDurante la maturazione i tannini dei semi evolvo-no, come dimostrato dal cambiamento di colore e di“gusto”. In questo lavoro abbiamo provato a sviluppa-re un indice obiettivo, facile e veloce, utile per i pro-duttori vitivinicoli.In questa direzione abbiamo proposto due diffe-renti indici spettrofotometrici, uno relativo alla strut-tura molecolare ed ai legami tra le sub unità flavanoli-che, e l’altro legato alle proprietà antiossidanti.Specialmente il secondo ha dato risultati molto inte-ressanti ed inaspettati. Anche se i polifenoli dell’uvasi ossidano durante la maturazione, le loro proprietàantiossidanti aumentano. I risultati ottenuti nel 2009sono stati molto motivanti, anche se una validazionesarà necessaria nel 2010.Fig. 4 - Regressione lineare dell’indice antiossidante in relazio-ne al cambiamento di colore dei semi (R2 = 0,590;  y = 0,785* x + 10,898).  Fig. 4 - Linear regression of the antioxidant index in relation tothe seed color index (R2 = 0.590; y = 0.785 * x + 10.898).Fig. 5 - Regressione lineare dell’indice antiossidante in relazionealla data di campionamento (R2 = 0,640; y = 0,056 * x + 2,5499).Fig. 5 - Linear regression of the antioxidant index in relation tothe day of the year (R2 = 0.640; y = 0,056 * x + 2,5499).Fig. 6 - Eesempio di prodotto di ossidazione di unaproantocianidina (Allen, 1998).Fig. 6 - Example of oxidation product (Allen, 1998).Fig. 7 - Possibile delocalizzazione del radicale libero ottenuto dalprodotto di ossidazione disegnato in figura 6.Fig. 7 - Hypothetical free radical stabilization of the oxidationproduct drown in figure 6.Sessione III239RiassuntoDurante la maturazione il vinacciolo imbrunisce, acausa di fenomeni ossidativi. Obiettivo del lavoro èsviluppare un nuovo indice di maturità fenolica checorreli bene con il colore del seme, semplice, rapido,con l’utilizzo di strumentazioni diffuse.L’esperimento si è svolto nel 2009, in Oltrepò pavese,su Pinot Nero e Merlot. Attraverso prove spettrofoto-metriche sono stati ottenuti due indici legati al cam-biamento della struttura molecolare e al potere antios-sidante. Entrambi correlano significativamente siacon la data di campionamento sia con il cambiamentodi colore del seme. La varietà ha un effetto seconda-rio, presupposto indispensabile per la diffusione delmetodo su cultivar differenti.Parole chiave: polifenoli, qualità, tannini, uva, Vitisvinifera.BibliografiaADAMS D.O., 2006. Phenolics and ripening in grape berries. Am.J. Enol. Vitic., 57(3): 249-256.ALLEN M., 1998. Phenolics demystified. Proc. ASVO oenologyseminar. Phenolics and extraction. Adelaide, 9 October 1997.Australian Society of Viticulture and Oenology.AQIL F., AHMAD I., MEHMOOD Z., 2006. 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Sviluppo di un nuovo indice di maturità fenolica basato sull’ossidazione dei vinaccioli

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