Analiza miRNA domaćina i herpes simpleks virusa 1 tijekom produktivne i latentne infekcije

Abstract

Viruses significantly perturb cell metabolism during infection and guide their functions toward efficient virus replication. Previous studies have shown that herpes simplex virus 1, while also encoding its own microRNAs (miRNAs), leads to significant changes in host miRNA expression. However, the exact role of such deregulation has not been elucidated. In this study, we comprehensively analyzed host and HSV-1 encoded miRNAs during productive and latent infection by applying a next-generation sequencing approach and bioinformatic analyses followed by functional studies. Firstly, to study host miRNA changes during productive HSV-1 infection, we determined differentially expressed miRNAs in various HSV-1 infected cells in culture. We found a cluster of co-expressed host miRNAs, miR-183/96/182, that was reproducibly upregulated in primary cells. Interestingly, we found that miRNAs of this cluster share common targets, including the Forkhead box O (FoxO) family of transcription factors. We observed a slight increase followed by a decrease of FoxO1 and FoxO3 transcripts and proteins during HSV-1 infection, which coincided with the expression of the miR-183/96/182. However, we found that overexpression of the miR-183/96/182 cluster is not required for the depletion of FoxO proteins. Nonetheless, to further examine the roles of these proteins in infection, we generated cells deficient for FoxO1 and FoxO3 using the CRISPRCas9 technology. Our results show that individual FoxO1 or FoxO3 protein is not required for efficient virus infection. In the second part of the study, we analyzed HSV-1 miRNAs in great detail by comparing a large number of sequencing experiments (i.e., datasets). One part of the datasets was generated in-house by sequencing, and the other was obtained from public databases. Thus far, 29 mature miRNAs have been found encoded by HSV-1, the functions of which are largely unknown. However, we have noticed significant discrepancies between reports including a lack of consistency in miRNA sequences.Tijekom infekcije virusi značajno mijenjaju biologiju stanice, te pritom podređuju i usmjeravaju njezine funkcije u smjeru efikasne virusne replikacije. Prethodne studije su pokazale da herpes simpleks virus 1, osim što kodira svoje mikroRNA (miRNA), dovodi i do značajnih promjena u ekspresiji miRNA domaćina, za što se smatra da bi moglo dovoditi do stvaranja pogodnih uvjeta za replikaciju virusa, no točne uloge tih promjena nisu detaljno analizirane. Kako bi opširnije prikazali analizu miRNA domaćina te HSV-1, istraživanje je podijeljeno na dva dijela, prvi dio, koji čini analiza diferencijalnih promjena miRNA domaćina tijekom infekcije te drugi dio gdje su detaljnije analizirane miRNA HSV-1. Prvo, kako bi proučili promjene miRNA domaćina tijekom infekcije HSV-1, napravili smo profil diferencijalno eksprimiranih miRNA, te pokazali da je klaster miRNA domaćina koje se zajedno eksprimiraju, miR-183/96/182, reproducibilno povećano eksprimiran u primarnim stanicama u kulturi. Traženjem zajedničkih meta navedenih miRNA, od potencijalnih kandidata izdvojili smo Forkhead box O (FoxO) porodicu transkripcijskih faktora te uočili njihovo blago povećanje nakon kojeg slijedi opadanje razine transkripata te proteina tokom infekcije HSV-1. Kako bi ispitali ulogu FoxO u infekciji, metodom CRISPR-Cas9 generirali smo stanice deficijentne za FoxO1 i FoxO3, no, uspoređujući replikaciju, uočili smo da FoxO1 ili FoxO3 ne igraju značajnu ulogu u replikaciji HSV-1. Drugo, kako bi detaljnije analizirali miRNA HSV-1, generirali smo i prikupili setove podataka dobivene sekvenciranjem malih RNA molekula uzoraka inficiranih sa HSV-1. Istraživanja su do sada pokazala da HSV-1 kodira 29 zrelih miRNA, čija funkcija nije u potpunosti razjašnjena. U tim dosadašnjim otkrićima sudjelovale su različite istraživačke grupe koje su u svojim istraživanjima primjenjivale različite kriterije za otkrića novih miRNA što je na kraju rezultiralo brojnim odstupanjima, uključujući i točne sekvence miRNA HSV-1. Kako bismo odredili točne sekvence miRNA HSV-1, te ispitali ekspresiju miRNA u latenciji u uzorcima čovjeka, usporedili smo sekvence miRNA između različitih virusnih sojeva i kliničkih izolata. Opsežna bioinformatička analiza pokazala je odstupanja sekvenci miRNA HSV-1 od objavljenih referentnih sekvenci, čime smo definirali najdominantnije sekvence 29 zrelih miRNA molekula HSV-1 u različitim fazama HSV-1 infekcije kako bi doprinijeli razumijevanju i olakšali buduće funkcionalne analize ovih miRNA molekula. Također smo kategorizirali sve poznate miRNA HSV-1 te sugeriramo da neke od prije objavljenih miRNA možda nisu izvorne regulatorne molekule, već artefakti sekvenciranja. Nadalje, opisujemo značajno posttranskripcijsko uređivanje hsv1-miR-H2-3p u latentno inficiranim ganglijima čovjeka, za razliku od in vitro uzoraka u produktivnoj fazi infekcije. Ovi rezultati ukazuju na to da virus koristi stanične procese kako bi proširio repertoar mogućih meta miRNA ili na taj način utječe na njihovu stabilnost