Phages anti-Pseudomonas aeruginosa pour le traitement des plaies brûlées infectées. Evaluation in vitro et résultats préliminaires de la mise au point d'un modèle ex vivo.

Abstract

Les bactériophages sont des virus spécifiques aux bactéries. Ils ont été découverts au début du 20ème siècle en France. Les premières études les concernant comme thérapie pour les infections bactériennes ont été conduites par Felix D'Hérelle à l'Institut Pasteur à Paris en collaboration avec George Eliava, un scientifique géorgien. Lorsque la pénicilline est apparue sur le marché dans les années 1930, les phages furent oubliés des pays de l'Ouest. Parallèlement, les pays de l'ancienne Union Soviétique ont continué à investiguer le potentiel de la phagothérapie. L'augmentation des résistances aux antibiotiques parmi les espèces bactériennes a ramené la considération des phages comme substituts ou compléments à la thérapie classique en Occident. Ce travail s'inscrit dans un large projet européen multicentrique intitulé PhagoBurn (www.phagoburn.eu) auquel participent le CHUV et l'UNIL. Les principaux buts de ce travail de Master étaient : 1. de tester un cocktail de phages fourni par Pherecydes Pharma© contre des souches de l'une des plus préoccupantes bactéries multi-résistantes (BMR):Pseudomonas aeruginosa, 2. de contribuer à la mise au point d'un modèle ex vivo de peau brûlée infectée permettant l'étude, dans des conditions au plus proche de la réalité, de l'efficacité et de l'innocuité (impact sur le microbiome commensal) de la phagothérapie ainsi que de la dynamique des interactions phages-hôtes (apparition de résistances bactériennes aux phages par exemple). 13 phages fournis séparément ont été amplifiés avec une méthode de culture en double couche. La capacité lytique de chaque phage a été testée in vitro en appliquant en goutte le virus sur les souches PAO1 et PA14 cultivées en tapis dans des boîtes de Petri et dans des cultures liquides. Les résultats ont montré une différence de susceptibilité aux phages entre les souches. Ce fait s'explique par les propriétés intrinsèques des bactéries et des virus : les premières possèdent un arsenal varié de facteurs de résistance tandis que les seconds se lient uniquement sur des récepteurs très spécifiques. Par contraste à une thérapie monophagique, le cocktail apparait être efficace, prévenant l'expansion des bactéries in vitro sans pour autant tuer le germe en totalité. In vivo, une phagothérapie combinée avec les défenses de l'hôte ou les antibiotiques pourrait offrir une voie pour éliminer la source de l'infection entièrement. Evidemment, cette assomption a besoin de plus d'études pour être confirmée. Trois souches de P. aeruginosa (PAO1, PAO1.B5 et PA14) ont été transfectées avec le plasmide pUX-BF13 et les gènes GFP-2 et mCherry par des techniques classiques d'électroporation. La collaboration avec le groupe de la Professeur Applegate et avec le Service de Chirurgie Plastique du CHUV a permis d'acquérir des échantillons humains. La première étape a été d'établir un modèle ex vivo qui permette l'application de souches fluorescentes de P. aeruginosa et l'observation, au travers de la microscopie et de l'immunohistochimie (IHC), du pattern de croissance et du comportement. Une contamination périphérique a souvent eu lieu sur les échantillons de peau qui a été attribuée soit aux champignons, soit aux souches bactériennes inoculées dans le contexte expérimental. Le processus de nettoyage et de préparation des échantillons, l'épaisseur de la peau, les conditions de culture, l'équipement et la stérilité des incubateurs sont autant de facteurs qui ont pu jouer un rôle dans les contaminations rencontrées. La microscopie de la peau a révélé une autofluorescence dans le spectre vert qui chevauchait le signal de GFP-2. Il a été décidé alors d'essayer les futures expériences avec les cellules mCherry. L'IHC n'a pas donné de résultat car les coupes histologiques ont été détruites dans le procédé de préparation. Le manque de temps a entravé les tentatives de modélisation. Ce travail jette un regard global sur une approche nouvellement ravivée pour traiter les infections bactériennes. Le développement de la connaissance en matière de génomiques et de nouvelles technologies, comme l'imagerie cellulaire, donnent des perspectives non négligeables à la phagothérapie, spécialement dans un contexte d'une expansion mondiale de bactéries BMR