Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraAs neoplasias mieloproliferativas (MPN) são doenças da “stem-cell”
hematopoiética e que estão associadas à ocorrência de eventos trombohemorragicos.
Diferentes estudos sugerem que doentes com Policitémia Vera (PV) e Trombocitémia
Essencial (ET) apresentam um estado protrombótico e que este poderá estar
relacionado não só com a activação constitutiva da via JAK/STAT mas também com a
carga alélica da mutação JAK2V617F.
Objectivo: Investigar a presença de marcadores de activação hemostática e a relação
destes com a carga alélica JAK2V617F e trombose.
Métodos: Foram estudados 28 PV, 47 ET e 48 controlos saudáveis. Os doentes estão
clinicamente estáveis e sob tratamento com Hidroxiureia; tempo de seguimento de 78
meses nas PV e de 84 meses nas ET. Sete doentes com PV e 16 com ET
apresentaram história de trombose ao diagnóstico. Após consentimento informado, os
doentes suspenderam a aspirina nos 10 dias prévios ao estudo. Por citometria de fluxo
(FACSCalibur, BD) avaliou-se: expressão de P-selectina (CD62P) e granulofisina
(CD63) plaquetar, basal e após estímulo com agonistas; capacidade de captação e
libertação de mepacrina nas plaquetas; agregados plaqueta-leucócito; expressão de
CD11b nos leucócitos e de factor tecidular (TF) nos monócitos, basal e após estímulo
com LPS. A pesquisa da mutação JAK2V617F foi efectuada por PCR alelo específica
e a quantificação por PCR em Tempo Real (JAK2 MutaQuant, Ipsogen). O screening
de mutações no exão 10 do gene MPL, foi efectuado por SSCP e as mutações
identificadas por sequenciação (ABI 310 Genetic Analyzer, AB).
Resultados: A mutação JAK2V617F foi encontrada em 28 PV (100%) e 28 ET (60%);
2 doentes com ET, apresentam mutações no exão 10 do gene MPL: W515L e R524C.
Os doentes apresentam um aumento significativo de expressão basal de CD62P e de
CD63 e de resposta ao ácido araquidónico; em todos os doentes a resposta ao TRAP6
está significativamente diminuída; 77% das PV e 50% das ET apresentam um fenótipode “storage pool disease”. Todos os doentes apresentam um aumento significativo de
expressão basal de CD11b nos leucócitos e de TF nos monócitos. Os agregados
plaqueta-leucócito estão significativamente aumentados em todos os doentes, sendo
que os agregados plaqueta-neutrófilo (PMN) estão significativamente aumentados nas
ET vs PV. Os doentes com carga alélica JAK2V617F>50% apresentam um aumento
significativo na expressão de CD11b nos leucócitos e de agregados plaqueta-PMN,
em comparação com os doentes com carga alélica <50%; as PV com carga alélica
>50% apresentam um aumento estatisticamente significativo de TF nos monócitos.
Nas ET, foi encontrada uma correlação estatisticamente significativa entre trombose e
a presença de mutações JAK2V617F ou MPL, e entre trombose e carga alélica>50%.
Esta associação não foi encontrada nas PV. A relação entre carga alélica e alterações
plaquetares é difícil de estabelecer, uma vez que não foram encontradas alterações
estatisticamente significativas.
Discussão: Os dados apresentados mostram, com significado estatístico, que os
doentes com PV e ET apresentam plaquetas e leucócitos activados e um aumento de
agregados plaqueta-leucócito em circulação. Os doentes com carga alélica>50%
apresentam marcadores de activação significativamente aumentados em comparação
com os doentes com carga alélica <50%, consistente com a influência da carga alélica
e perda de heterozigotia para a mutação JAK2V617F na activação celular. Nas ET a
presença da mutação e a carga alélica >50% está significativamente associada a
eventos trombóticos ao diagnóstico.
Conclusão: Uma vez que as tromboses representam, nos doentes com MPN, uma
das principais causas de co-morbilidade, foram investigados marcadores de activação
da hemostase e a sua relação com a carga alélica JAK2V617F. Os resultados
apresentados ilustram diferentes mecanismos que favorecem a trombose nas PV e
ET, nomeadamente, activação basal das plaquetas, monócitos e PMN, aumento de FT
nos monócitos e de aumento de agregados plaqueta-leucócito em circulação.Introduction: Myeloproliferative neoplasms (MPN) are stem cell-derived proliferative
diseases associated with thrombohemorragic diathesis. Different studies suggested
that Polycythemia Vera (PV) and Essential Thrombocythemia (ET) patients have a
baseline protrombotic status, which could be related to constitutive JAK2/STAT
signalization in correlation with JAK2V617F mutation allele burden.
Objective: Investigate the baseline hemostatic activation markers and their correlation
with the JAK2V617F allele burden and thrombosis.
Methods: 28 PV and 47 ET patients and a control group of 48 healthy volunteers were
studied. All the patients are under hydroxyurea treatment and remain clinically stable
with follow up periods of 78 months for PV and 84 months for ET. Seven PV and 16 ET
patients have a history of thrombosis at diagnosis. With patients’ written informed
consent, aspirin was withdrawn for 10 days prior the studies. Using flow cytometry
(FACSCalibur, BD), we evaluated: platelet P-selectin (CD62P) and granulophysin
(CD63), at baseline and after stimulation with agonists; platelet uptake and release of
mepacrine; platelet-leukocyte aggregates, leukocyte CD11b and monocyte Tissue
factor (TF) at baseline and after stimulation with LPS. JAK2V617F allele was detected
by Allele specific PCR and quantified by Allele specific Real Time PCR (JAK2
MutaQuant, Ipsogen). MPL exon 10 mutations were screened by SSCP and identified
by direct sequencing (ABI 310 Genetic Analyzer, Applied Biosystems).
Results: JAK2V617F mutation was found in 28 PV patients (100%) and in 28 ET
patients (60%). In two other ET patients we found MPL gene exon 10 mutations:
W515L and R524C. All patients have, at baseline, a significant increased expression of
CD62P and CD63, and a significant increase response to arachidonic acid and
diminished levels of CD62P and CD63 following TRAP6 activation. A phenotype of
storage pool disease was found in 77% of PV and 50% of ET patients. At baseline all
patients have activated leukocytes with a statistically significant increase in CD11bexpression and monocyte-TF. The latter was significantly elevated in PV vs ET
patients. Circulating platelet-leukocytes aggregates were significant higher in all
patients; in the ET, platelet-PMN aggregates were significantly increased vs PV
patients. Patients with JAK2V617F>50%, have a statistically significant increase in
leukocytes CD11b expression and in platelet PMN-aggregates, in comparison with
those with JAK2V617F50% have a statistically
significant increase in monocytes-TF. In ET patients we found a statistically significant
correlation between thrombosis and JAK2 or MPL mutations, furthermore, ET patients
with JAK2V617F allele burden >50% have statistically higher incidence of thrombosis.
No such correlation in PV patients. Regarding to platelets activation, it’s not evident
such effect since no significantly differences were found.
Discussion: These data shown, with statistically significance that PV and ET patients
have circulating activated platelets and leukocytes, and increased number of plateletleukocyte
aggregates. Consistent with the influence of allele burden and acquisition of
loss of heterozygosity for the JAK2V617F mutation in leukocyte activation, all patients
with allele burden >50% presented significantly increased activation markers
comparing to patients with allele burden >50%. In ET patients the presence of
JAK2V617F mutation and allele burden>50% was significantly associated with a
previous history of thrombosis.
Conclusion: As thrombosis is one of the main co-morbilities in MPN patients, we
investigated the baseline hemostatic activation markers and their correlation with the
JAK2V617F allele burden. These data clearly illustrate several mechanisms favoring
thrombosis in PV and ET patients, namely, the baseline activation of platelets,
monocytes and PMNs leukocytes, increased monocyte-TF and platelet-leukocytes
aggregates