Tese de doutoramento em Química (Química Biológica), apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraOs organismos vivos possuem atributos comuns que os distinguem do
mundo inorgânico. Uma rede complexa de interacções entre moléculas orgânicas
propicia a existência e a perpetuação da vida. As proteínas são uma das mais
extraordinárias classes de biomoléculas, participando activamente em todos
os processos biológicos. Esta ubiquidade das proteínas deve-se à sua relativa
plasticidade conformacional, um requisito importante nas reacções bioquímicas,
processos dinâmicos por definição. A maioria das proteínas tem uma estrutura
tridimensional bem definida, essencial para a sua função biológica. Muitas das
doenças hoje conhecidas têm a sua origem num incorrecto funcionamento das
proteínas. O estudo da relação existente entre a estrutura de uma dada biomolécula
e a sua dinâmica, é um dos tópicos mais importantes na compreensão dos
mecanismos moleculares de múltiplas patologias.
Relativamente a esta temática, duas proteínas foram o sujeito de estudo na
elaboração desta tese. Foram utilizadas técnicas experimentais bem como protocolos
computacionais, onde diferentes aspectos biofísicos foram abordados.
A bactéria Staphylococcus aureus é responsável por inúmeros casos de septicémia.
Umas das toxinas excretadas pela bactéria para o plasma, a d-toxina, é
responsável pela desintegração membranar em organismos eucarióticos. Durante
o mecanismo infeccioso, o peptídeo experiencia a influência de diferentes
ambientes químicos, e por conseguinte com impacto na sua conformação
tridimensional. A estrutura anfipática helical do peptídeo foi estudada por
ressonância magnética nuclear (NMR). Simulações moleculares foram também
produzidas no estudo da plasticidade conformacional e propensão à agregação
do peptídeo em solução. A interacção do peptídeo com membranas foi também
estudado por dinâmica molecular. Os resultados evidenciam que o estado de agregação do peptídeo pode ser relevante para o processo lítico.
A transtirretina (TTR) humana é uma das muitas proteínas envolvidas em
doenças amilóides. Dependendo da amiloidogeneceidade da variante proteica,
a estabilidade do complexo tetramérico nativo é alterado, ocorrendo dissociação
e formação de espécies monoméricas com tendência para agregar. Os
agregados solúveis e as fibras amilóides insolúveis são responsáveis pelas alterações
morfológicas e morte celular observadas nestas patologias. Um método
computacional baseado em acoplagem molecular (“docking”) utilizando dados
experimentais foi desenvolvido nesta tese. O objectivo do protocolo centrou-se
na modelação molecular de um modelo protofilamentar, a unidade elementar
das fibras amilóides. Os modelos polimórficos obtidos foram agrupados de
acordo com a sua periodicidade helical, para posterior análise das interfaces
proteicas e qualidade estereoquímica das estruturas. Os modelos produzidos
poderão ter um impacto significativo em estudos terapêuticos com o objectivo
de produzir fármacos que inibam a formação das fibras amilóides.All living organisms possess common attributes that distinguishes them
from the surrounding inorganic matter. A complex network of interacting
organic molecules are responsible for the existence and perpetual of life. Among
the most extraordinary biomolecules are proteins. Proteins are the workhorses
of life, they actively participate in all biological processes. This is accomplished
through an intrinsic conformational plasticity, a requisite in all biochemical
reactions inherently dynamic processes. For most proteins a correct three
dimensional structure is essential for its biological function. It is a fact that
many diseases can be traced back to malfunction of proteins. Understanding
the underlying connection between the biomolecule structure and its dynamics,
is thus essential for current day medicine.
Throughout this thesis, two proteins were the subject of study using both
experimental and computational techniques. Different biophysical aspects were
focused stressing the importance of the usage of different approaches to get
complementary views.
d-lysin is a small peptide excreted by the bacteria Staphylococcus aureus,
responsible for the disruption of eukaryotic membranes in infection conditions.
On its way to the membrane, the peptide experience subtle chemical environment
changes with consequences on peptide conformation. The amphyphatic
helical structure of this peptide was studied using nuclear magnetic resonance
(NMR), and its conformational plasticity and propensity for aggregation in
solution was assessed through molecular dynamics (MD) simulations and NMR.
The first stages of the lytic process were also modeled by analyzing MD trajectories
describing the interaction of the peptide with a zwiterionic membrane.
The results show that peptide aggregation may play a key role in the process. Transthyretin (TTR) is one of the many proteins known to be involved in
human amyloid diseases. Depending on the protein variant amyloidogenicity,
the native tetrameric complex dissociates into monomeric species with high
tendency for aggregation. Soluble aggregates and insoluble amyloid fibrils
are responsible for the morphological alterations and cell observed in these
pathologies. We developed a computational method using protein docking
driven by experimental data, to build a high resolution molecular model of the
elementary units that constitute the fibrils. We obtained a polymorphic set of
protofilament models, further characterized in terms of helical periodicities
and interface match. The overall stereochemical quality of the structures was
assessed. This models may be a valuable instrument in the rational design of
compounds with therapeutic potential to inhibit amyloid fibril formation.Financial support for the execution and publication of this thesis was provided
by Fundação para a Ciência e Tecnologia through grant SFRH/BD/1354/200