Trabalho final do 6º Ano Médico com vista à atribuição do grau de Mestre no âmbito do Ciclo de Estudos de Mestrado Integrado em MedicinaO carcinoma hepatocelular é uma doença complexa e devastadora que se mantém resistente à quimioterapia convencional. O desenvolvimento de fármacos dirigidos às vias moleculares envolvidas na sobrevivência e proliferação das células neoplásicas, bem como a sua associação aos agentes convencionais poderá constituir uma nova abordagem no tratamento do carcinoma hepatocelular. O objectivo do presente estudo consiste na avaliação do potencial terapêutico dos novos fármacos dirigidos a alvos moleculares, nomeadamente os inibidores do proteasoma (MG-262), da farnesiltransferase (L-744832) e do mTOR (Everolimus), em monoterapia e em combinação com os agentes da quimioterapia convencional 5-Fluorouracilo e Doxorrubicina, em células de carcinoma hepatocelular em cultura, HUH-7. Para atingir estes objectivos, as células HUH-7 foram incubadas com concentrações crescentes de MG-262, L-744832 e Everolimus em monoterapia e em associação com 5-Fluorouracilo e Doxorrubicina durante diferentes intervalos de tempo. A viabilidade celular foi avaliada pelo teste Alamar Blue e o tipo de morte celular por microscopia óptica e citometria de fluxo, recorrendo à dupla marcação com anexina V e iodeto de propídio. Os mecanismos moleculares envolvidos na acção e citotoxicidade dos fármacos, nomeadamente, a expressão de conjugados de ubiquitina, lamininas A/C, ciclina D1 e de proteínas relacionadas com a morte celular (BAX e BCL2) foram também analisados por citometria de fluxo através de anticorpos monoclonais ligados a fluorocromos.
Os resultados obtidos indicam que o MG-262, o L-744832 e o Everolimus têm um efeito antiproliferativo e citotóxico em monoterapia que varia em função da dose utilizada e do tempo de incubação. Induzem morte celular principalmente por apoptose, a qual poderá estar relacionada com o aumento da razão BAX/BCL-2. Às 48h, o IC50 é, respectivamente, 100nM (MG-262), 77μM (L-744832) e 18μM (Everolimus). A combinação destes fármacos com os agentes terapêuticos convencionais demonstra aumento do efeito antiproliferativo para doses inferiores ao IC50 (sinergismo de adição). Além disso, o efeito citotóxico foi observado apenas nas associações do MG-262 com os fármacos da quimioterapia convencional. Este estudo sugere que os inibidores do proteasoma, os inibidores da farnesiltransferase e os inibidores do mTOR poderão constituir uma alternativa terapêutica no tratamento do carcinoma hepatocelular tanto em monoterapia como em associação com os fármacos convencionais. A escolha de um esquema terapêutico adequado será também crucial para o sucesso do tratamento.Hepatocellular carcinoma is a complex and devastating disease which remains highly resistant to commonly used systemic chemotherapy. Alternative treatment strategies focus on specific pathways involved in malignant cell survival and proliferation, as well as combination of different targeted therapies with conventional anticarcinogenic agents may open new horizons in hepatocellular carcinoma therapy. The aim of the present study is to test the therapeutic potential of new targeted drugs in hepatocellular carcinoma, namely the proteasome (MG-262), farnesiltransferase (L-744832) and m-TOR (Everolimus) inhibitors, in monotherapy and in combination with conventional anticarcinogenic agents, 5-Fluorouracil and Doxorrubicin, in the hepatocellular carcinoma cell line, HUH-7. To attaint this purpose, the HCC cell line, HUH-7 cells, were incubated with increasing concentrations of MG-262, L-744832 and Everolimus, both as single agents and in association with 5-Fluorouracil and Doxorrubicin, during different periods of time. Cell viability was evaluated by the Alamar Blue assay and cell death by optic microscopy and flow citometry using annexin V and propidium iodide incorporation. The molecullar mechanisms involved in drug citotoxicity, namely the expression of ubiquitin conjugates, laminin A/C, cyclin D1 and proteins related to cell death (BAX and BCL2), were analysed by flow cytometry using monoclonal antibodies labeled with fluorochromes.
The obtained results show that MG-262, L-744832 and Everolimus have an antiproliferative and cytotoxic effect in monotherapy, depending on the applied dose and incubation period, inducing cell death mainly by apoptosis that may be related with the increase in BAX/BCL-2 ratio. The IC50 at 48h for each drug is: MG-262=100nM, L-744832=77μM, Everolimus=18μM. The combination of MG-262, L-744832 and Everolimus with conventional anticarcinogenic drugs reveals an increase in antiproliferative effect for lower doses than the IC50 (addition synergism). However, the cytotoxic effect is only observed with MG-262 in association with the conventional anticarcinogenic drugs. These results suggest that proteasome, farnesiltransferase and mTOR inhibitors may constitute a new potential therapeutic approach in HCC not only in monotherapy, but also in association with conventional therapies. The choice of an optimal drug schedule will also be crucial to the success of the therapy.This work was supported by a grant from GAPI – Office for Support of Investigational Projects, Faculty of Medicine of the University of Coimbra and Callouste Gulbenkian Foundation, Portugal
