Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.O Ca2+ presente nos espermatozóides pode provenir de duas fontes: uma extracelular, mediada por canais de Ca2+ na membrana plasmática e uma intracelular devido à abertura de canais libertadores de Ca2+ em dois reservatórios de Ca2+ - o acrossoma e o envelope nuclear redundante (RNE). Existem dois tipos de canais membranares de Ca2+ presentes nos espermatozoides: uns responsáveis pelo seu influxo tais como CatSper, VOCC, SOC e CNG e outros pela sua dispersão para o meio envolvente como PMCA e NCX. Os reservatórios intracelulares de Ca2+ também possuem canais para o seu efluxo (IP3R e RyR) e para a dispersão de Ca2+ citoplasmática / inclusão nos reservatórios (SERCAs e SPCAs).
Estudos em reservatórios, canais, bombas e permutadores de Ca2+ bem como as suas interacções internas e efeitos em actividades do espermatozoide requerem o uso de moduladores farmacológicos quer para inibir ou induzir transporte de Ca2+ ou simplesmente afectar directamente a mobilidade ou reacção acrossómica do espermatozóide. No presente estudo, seis moduladores foram usados por forma a esclarecer a intercomunicação entre CatSper e os reservatórios intracelulares de Ca2+ (especialmente o RNE) e os seus efeitos na motilidade do espermatozóide humano; progesterona - um indutor geral da concentração de Ca2+ intracelular), Mibefradil dihydrochloride hydrate e NNC 55-0396 dihydrochloride - inibidores de CatSper e, consequentemente, influxo de Ca2+, thimerosal e 4-aminopyridine - mobilizadores de Ca2+ armazenado e indutores de influxo de Ca2+ e trimethylamine hydrochloride - um indutor alcalino do influxo de Ca2+.
Com este trabalho, foi possível concluir que o TMA induz eficientemente o influxo de Ca2+ através de CatSper, enquanto que o Mibefradil e o NNC actuam negativamente nestes canais, interferindo com o influxo bem como a resposta induzida pela progesterona; ademais, o thimerosal e a 4-aminopyridine causam um aumento do Ca2+ intracelular que parece ser parcialmente mediado pelos reservatórios de Ca2+, nomeadamente o RNE. Nos estudos de motilidade, os espermatozóides tratados com TMA, Mibefradil e NNC apresentaram uma mudança no seu movimento: velocidade aumentada quando estimulados com TMA e Mibefradil e velocidade
VI
diminuída com NNC. As diferenças encontradas entre o controlo (com sEBSS) e o tratamento com thimerosal ou 4-aminopyridine não foram significativas, segundo o teste t de Student. Assim sendo, existe uma intercomunicação relevante entre CatSper e reservatórios intracelulares de Ca2+ que previne a descida de Ca2+ intracelular para níveis anormais e também afecta a mobilidade espermática, quando interrompida.Ca2+ in sperm can come from two sources: an extracellular one, mediated by plasma membrane Ca2+ channels and an intracellular one due to the opening of Ca2+-release channels in the two Ca2+ stores - the acrosome and the RNE. There are two types of plasma membrane channels present in sperm: the ones responsible for Ca2+ influx such as CatSper, VOCC, SOC and CNG and those accountable for Ca2+ clearance to the surrounding medium like PMCA and NCX. Intracellular Ca2+ stores also possess channels for Ca2+ efflux (IP3R and RyR) and for cytoplasmic Ca2+ clearance/inclusion into the stores (SERCAs and SPCAs).
Studies of Ca2+ stores, channels, pumps and exchangers as well as its internal interactions and effects on sperm activities require the use of pharmacological modulators either to inhibit or induce Ca2+ transportation or simply affect directly sperm motility or acrosome reaction. In the present work, six modulators were used in order to clarify the intercommunication between CatSper channels and intracellular Ca2+ stores (especially the RNE) and its effects on human sperm motility. Progesterone - a general inducer of [Ca2+]i, Mibefradil dihydrochloride hydrate and NNC 55-0396 dihydrochloride - inhibitors of CatSper and thus Ca2+ influx, thimerosal and 4-aminopyridine - mobilisers of stored Ca2+ and inducers of Ca2+ influx and trimethylamine hydrochloride – an alkaline inducer of Ca2+ influx.
With this work, it was possible to conclude that TMA efficiently induces Ca2+ influx through CatSper whilst Mibefradil and NNC act negatively on them hence interfering with the influx and also with the progesterone-induced response; moreover, thimerosal and 4-aminopyridine cause a rise of intracellular Ca2+ which appears to be partially mediated by intracellular Ca2+ stores, namely RNE. With the motility studies, TMA, Mibefradil and NNC-treated cells presented a change in swimming pattern: increased velocity when stimulated with TMA and Mibefradil and decreased velocity when with NNC. No statistical significance was attributed to the differences seen between thimerosal and 4-aminopyridine treatment the control (with sEBSS), accordingly to test t of Student. Therefore, there is a relevant intercommunication between CatSper and ICS that prevents the decrease of intracellular Ca2+ to abnormal levels and also affects sperm motility, when interrupted
