Dissertação de mestrado em Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraNos últimos anos têm sido desenvolvidas várias ferramentas para permitir o controlo de
neurónios específicos, possibilitando o estudo da sua função. Estas novas ferramentas superam a
falta de selectividade e o fraco controlo temporal proveniente do uso de estimulação eléctrica
no controlo de actividade neuronal.
A optogenética refere-se á integração de óptica e genética para obter um ganho ou
perda de função em eventos bem definidos dentro de células específicas em tecido vivo. A
capacidade de “ligar” e “desligar” neurónios utilizando luz é de facto uma tecnologia inovadora
que oferece uma solução para limitações passadas. A optogenética, considerada por vários
especialistas como ‘’método do ano’’ e ‘’inovação da década’’, em 2010, é utilizada para
hiperpolarizar ou despolarizar neurónios alvo, de uma forma menos invasiva, utilizando luz e
usufruindo de uma alta resolução espacial e escala temporal na ordem dos milissegundos. Esta
técnica tem permitido o mapeamento e estudo de redes neuronais com uma grande eficácia.
A ‘’Channelrhodopsin-2’’ (ChR2) é um canal catiónico sensível à luz, derivado da
microalga Chlamydomonas reinhardtii. Na última década, a ChR2 tornou-se o arquétipo central e
a principal ferramenta da optogenética. Actualmente, a caixa de ferramentas optogenética está
em contínua actualização, com contribuições de estratégias de engenharia protéica, tais como
mutagénese dirigida e a construção de quimeras com troca de domínios de diferentes espécies
de channelrhodopsin. No entanto, alguns aspectos da forma ‘’wild-type’’ da ChR2 ainda
requerem atenção e melhoramento. Estes incluem o seu espectro de acção, cinética, níveis de
expressão, inactivação, condutância e exactidão de pico de absorção. Em termos de
propriedades espectrais, poucas variantes desta proteína têm sido geradas e completamente
caracterizadas com sucesso. No entanto, o aprimorar do espectro de activação da ChR2 e do
formato do respectivo pico de absorção são algumas das propriedades mais desejadas.
A ChR2 é excitada preferencialmente com comprimentos de onda de luz azul (470nm),
o que limita o seu uso em material biológico de alta taxa de difusão, tal como o cérebro. Luz de
excitação com maiores comprimentos de onda diminui a difusão de luz produzida por tecidos
biológicos, e não é absorvida pela hemoglobina, assim, formas da ChR2 ‘’red-shifted’’, a absorver
luz vermelha ou mesmo perto de infravermelha, são ferramentas desejáveis para a excitação de
tecidos profundos.
Alem disto, variantes ‘’blue-shifted’’ são também ferramentas atrativas para desenvolver,
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dado que a combinação de várias ChR2 que apresentem sensibilidades a diversos comprimentos
de onda permitiriam a estimulação de diferentes populações neuronais sem interferência entre
si.
Neste projecto, realizámos um desenho ab-initio para produzir quatro novas variantes de
ChR2, usando uma abordagem de mutagénese dirigida no ambiente do cromófero da ChR2
alterando de forma radical os resíduos alvo. As mutações foram selecionadas com a aplicação de
Time Dependent – Density Functional Theory (TDDFT) para prever o espectro de absorção dos
mutantes selecionados da ChR2. O ‘’colour tuning’’ da ChR2 foi alcançado em quatro novas
variantes criadas. Em particular, fomos capazes de gerar três variantes ‘’red-shifted’’ e uma
‘’blue-shifted’’. Após caracterização espectral, as variantes F217D e F269D apresentaram um
‘’red-shift’’ significativo de 90nm, a variante L221D apresentou um ‘’red-shift’’ de 180nm, a
variante F269H apresentou um ‘’blue-shift’’ de 20nm. Apesar dos nossos resultados, é
necessária uma caracterização protéica adicional, tal como a avaliação do tráfego membranar em
neurónios e as características electrofisiológicas destes novos mutantes para determinar as
proriedades cinéticas do canal.
Neste trabalho, também conseguimos definir e descrever com sucesso a expressão e
purificação da ChR2 ‘’wild-type’’ e de todas as quatro novas variantes no sistema eucariótico de
expressão heteróloga - Pichia pastoris. Por fim, o nosso estudo valida as previsões de Time-
Dependent Density Functional Theory e revela que abordagens de simulação biofísica podem
ser utilizadas com vista à criação de variantes de ChR2 inteligentemente desenhadas.
O desenho de novas variantes ChR2, seguindo a lógica racional aplicada, é uma
abordagem poderosa e fiável para obter proteínas optimizadas para estratégias biotecnológicas.
Os resultados originais obtidos com este trabalho demonstram potential para aplicações futuras,
já que novas e melhoradas variantes de ChR2 continuarão a desempenhar um papel central no
desenvolvimento e implementação da optogenéticaOver the last few years, several tools have been developed to allow the control over
specific types of neuron to enable the study of their function. These novel tools aim to
overcome the lack of selectivity and the poor temporal control that derives from trying to
control neuronal activity with electrical stimulation.
Optogenetics refers to the integration of optics and genetics to obtain gain or loss of
function in well-defined events and within specific cells in living tissue. The capacity to turn
neurons “on and off” using light is indeed a groundbreaking technology that has become a
solution for past limitations. Considered by many, “method of the year” and “breakthrough of
the decade”, in 2010, optogenetics is used to hyperpolarize or depolarize specific targeted
neurons using light in a less invasive manner, with high spatial resolution and a temporal
resolution on the scale of milliseconds. This technique has allowed the mapping and study of
neuronal networks with demonstrated efficacy.
Channelrhodopsin-2 (ChR2) is a light-gated cation channel, derived from the microalga
Chlamydomonas reinhardtii. In the last decade, ChR2 has become the central archetype and the
main tool of optogenetics. Presently, the optogenetic toolbox is under continuous update, with
contributions from protein engineering strategies, such as site-directed mutagenesis and
construction of chimeras with domain swaps between channelrhodopsins of different species.
However, some aspects of the wild-type form of ChR2 still require attention and enhancement.
These include its action spectra, kinetics, expression levels, inactivation, conductance and
absorption peak sharpness. In terms of spectral properties, few variants of this protein have
been successfully generated and fully characterized. Nevertheless, tuning of ChR2 activation
spectra and absorption peak sharpness are one of the most sought after properties.
ChR2 is optimally excitable at a wavelength of blue light (470nm), which limits its use in
high light-scattering biologic material, such as the brain. However, long-wavelength excitation
light decreases the scattering of light produced by biological tissues and is not absorbed by
haemoglobin. Thus, a red-shifted form of ChR2, absorbing red or even near infrared light would
be a desirable tool for the excitation of relatively deep tissues.
Furthermore, blue-shifted variants would also be attractive tools to develop, since the
combination of ChR2 proteins with well separate wavelength sensitivities, combined with multicoloured
optics, would permit the stimulation of different neuronal populations with no
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interference between them.
In this project, we performed ab-initio design to produce four new ChR2 variants, using a
radical site-directed mutagenesis approach on target residues in the environment of the ChR2
chromophore. The mutations were selected with the application of Time Dependent – Density
Functional Theory (TDDFT) to predict the absorption spectra of ChR2 selected mutants. We
achieved successful colour tuning of ChR2 with our four newly created variants. In particular,
we were able to generate three red-shifted and one blue–shifted variant. After spectral
characterization, the F217D and F269D variants presented a significant 90nm red shift, the
L221D variant had a 180nm red shift and the F269H variant presented a 20nm blue shift.
Despite our results, additional protein characterization is needed, such as the assessment of
membrane trafficking in neurons and an electrophysiological characterization to determine
channel kinetic proprieties for each of the variants.
In this work, we were also able to define and describe the successful expression and
purification of wild type ChR2 and of all the new four variants using the eukaryotic Pichia pastoris
heterologous expression system. Finally, our study validates Time-Dependent Density
Functional Theory predictions and reveals that biophysical simulation approaches may be used
towards the creation of intelligently designed ChR2 variants.
The design of new ChR2 variants, following our applied rationale, is a powerful and
reliable approach to obtain enhanced proteins for biotechnological strategies. The original
output obtained here shows potential for future optogenetic application, as new and improved
ChR2 variants will continue to play a central role in the development and implementation of
optogenetic