Trabalho de projecto de mestrado em Medicina (Biologia Celular e Molecular) apresentado à Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraIntroduction: Hyperglycemia and tissue ischemia are two main features of most of diabetic
complications. It has been suggested that high glucose impairs the cell and tissue adaptation
to low oxygen, leading to cell death and tissue dysfunction. The loss of cell response to
hypoxia, observed in most of diabetic tissues, appears to result from a destabilization of the
transcription factor HIF-1 (Hypoxia-Inducible Factor-1) induced by high levels of glucose or
methylglyoxal (MGO), a well-known by-product of glycolysis. However, the molecular
mechanisms involved in this process remain elusive.
Objectives: This study aims to clarify the molecular mechanisms that may be involved in the
destabilization of HIF-1α in the presence of high glucose or high levels of MGO.
Methodology: A human cell line from retinal pigment epithelium (ARPE-19) was used in
this study to investigate the role of high glucose or high levels of MGO in the regulation of
HIF-1α. Immunocytochemistry, western blot and immunoprecipitation assays were used to
determine the cellular distribution, stability and ubiquitination of HIF-1α, respectively. We
further used short-hairpin RNAs (shRNAs) against CHIP to test the function of this ubiquitin
ligase in the destabilization of HIF-1α in the presence of MGO or high glucose.
Results: Data shows that MGO and high glucose induce downregulation of HIF-1α in
ARPE-19 cells, under normoxia and hypoxia conditions. Additionally, results indicate that
MGO decreases the accumulation of HIF-1α into the nucleus, under hypoxia, and decreases
the expression of VEGF-A, a well-known target gene of HIF-1. These data suggests that
MGO decreases the transcriptional activity of HIF-1, under hypoxia conditions. Data further
shows that CHIP, which is an ubiquitin ligase involved in protein quality control mechanisms,
has an important role in the ubiquitination and destabilization of HIF-1α in the presence of
increased levels of MGO or high glucose, under hypoxia conditions.
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Conclusions: This work suggests that the loss of cell response to hypoxia in diabetes might
be associated with increased degradation and decreased stability of the transcription factor
HIF-1, due to the activation of a mechanism, which involves ubiquitination of HIF-1α by
CHIP, induced by high levels of MGO or high glucose.Introdução: A hiperglicemia e a isquémia tecidular são duas características importantes de
muitas das complicações da diabetes. Tem vindo a ser sugerido que níveis elevados de glicose
comprometem a adaptação celular a níveis reduzidos de oxigénio, conduzindo a morte celular
e disfunção tecidular. Essa perda de reposta celular à hipoxia, característica da diabetes,
parece resultar de uma destabilização do factor de transcrição Hypoxia Inducible Factor-1
(HIF-1) induzida por níveis elevados de metilglioxal (MGO), um produto secundário da
glicólise, ou alta glicose. No entanto, os mecanismos moleculares envolvidos neste processo
continuam ainda pouco claros.
Objectivos: Este trabalho tem como objectivo esclarecer alguns dos mecanismos moleculares
que podem estar na origem da destabilização do HIF-1α na presença de alta glicose ou níveis
elevados de MGO.
Metodologia: Neste trabalho foi usada uma linha celular humana de epitélio pigmentado da
retina (ARPE-19) para testar os efeitos da alta glicose ou níveis elevados de MGO na
expressão de HIF-1α. Foram usadas técnicas de imunocitoquímica, western-blot e
imunoprecipitação para determinar a localização celular, estabilização e ubiquitinação do
HIF-1α, respectivamente. Foram ainda testados short-hairpin RNAs (shRNAs) contra a CHIP,
para testar a função desta ligase de ubiquitina na destabilização do HIF-1α na presença de
MGO ou alta glicose.
Resultados: Os resultados obtidos mostram que o MGO e concentrações elevadas de glicose
diminuem os níveis de HIF-1α, em células ARPE-19, em condições de normoxia e hipoxia.
Verificou-se ainda que o MGO diminui a acumulação de HIF-1α no núcleo e diminui a
expressão de VEGF-A, um gene alvo do HIF-1, o que poderá indicar uma diminuição da
actividade de transcrição deste factor. Os resultados indicam ainda que a CHIP, uma ligase de
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ubiquitina envolvida no controlo de qualidade proteica, tem uma função importante na
ubiquitinação e destabilização do HIF-1α na presença de níveis elevados de MGO ou glicose
em condições de hipoxia.
Conclusões: Este trabalho sugere que a perda de resposta celular à hipoxia na diabetes pode
estar associada a um aumento da degradação e diminuição da estabilidade do factor de
transcrição HIF-1, através de um mecanismo que envolve a sua ubiquitinação, pela ligase de
ubiquitina CHIP, induzida por níveis elevados de MGO ou alta glicose
