Para la planificación operativa de los sistemas de transporte público es fundamental contar con una caracterización de la demanda del servicio por medio de una Matriz Origen-Destino (OD) de viajes que suministre información valiosa para la toma de decisiones en el proceso de optimización del sistema. Esta matriz es estimada frecuentemente mediante técnicas de muestreo estadístico que ofrecen resultados de gran calidad pero que requieren de diseños, implementación y análisis bastante complejos e implican un alto costo y mucho tiempo de ejecución. Por tal motivo, se hace pertinente aprovechar la información concentrada en los registros de las tarjetas inteligentes usadas como medios de pago en los sistemas de transportes que cuentan con esta tecnología. Esta fuente de información permite obtener estimaciones de matrices OD de gran calidad con un costo bastante bajo. En este trabajo se implementa una metodología para la estimación de una Matriz Origen-Destino entre estaciones de buses para el sistema de transporte público de MEGABÚS en la ciudad de Pereira. La metodología permite depurar la base de datos teniendo en cuenta las particularidades del sistema y obtener la reconstrucción de un gran porcentaje de los viajes originados en registros de entrada. El método usado posibilita estimar matrices OD para diferentes ventanas de tiempo de cualquier día de la semana y distintas épocas del año