Etude du rôle du ligand axial cystéine du site actif de la superoxyde réductase dans la réactivité avec le superoxyde

Abstract

The superoxide reductase (SOR) is an enzyme of detoxification present only at certain types of micro-organisms. It eliminates the radical superoxide by reducing it to give hydrogen peroxide without molecular oxygen formation. The active site of the SOR consists of a mononuclear chelated ferro-iron center by 4 histidines in equatorial positions and a cysteine in axial position. The presence and the positioning of this cysteine within the active site are completely atypical and could be at the origin of this particular reactivity with superoxide. Various structures of SOR showed the existence of hydrogen bonds between the sulphur of this cysteine and the peptide NH of connections of certain amino acids of which isoleucine 118 on which we centered our work. Four mutants of isoleucine 118 were built and purified. The characterizations by spectroscopies UV-visible, FTIR, Raman Resonance, by the determination of the pKa and the potential redox of the iron of the active site showed that the changes on this position induce a reinforcement of the connection S-Fe. This could be associated a weakening of the hydrogen bond between the peptide NH of the mutants of isoleucine 118 and the sulphur of cysteine. The studies of fast kinetics by pulse radiolysis made it possible to show that the changes facilitate the protonation of the reactional intermediaries of type Fe3+- peroxo and Fe3+- hydroxo. These results are in agreement with the increase in density electronic around iron of the active site, which induces a more important alkalinity of these reactional intermediaries. Thus, we could show that the reinforcement of the connection S-Fe has as a consequence the acceleration of the reaction of the SOR with superoxide. The axial ligand cysteine has thus as a role to control the electronic density around iron of the active site and thus to influence the reduction of superoxyde.La superoxyde réductase (SOR) est une enzyme de détoxification présente uniquement chez certain types de microorganismes. Elle élimine le radical superoxyde en le réduisant pour donner H2O2 sans formation d'O2 moléculaire. Le site actif de la SOR est constitué d'un centre mononucléaire de fer ferreux chélaté par 4 histidines en positions équatoriales et une cystéine en position axiale. La présence et le positionnement de cette cystéine au sein du site actif est tout à fait atypique et pourrait être à l'origine de cette réactivité particulière avec le superoxyde. Différentes structures de SOR ont montré l'existence de liaisons hydrogènes entre le soufre de cette cystéine et des NH de liaisons peptidiques de certains acides aminés dont l'isoleucine 118 sur laquelle nous avons centré notre travail. Quatre mutants de l'isoleucine 118 ont été construits et purifiés. Les caractérisations par spectroscopies UV-visible, FTIR, Résonance Raman, par la détermination du pKa et du potentiel redox du fer du site actif ont montré que les mutations sur cette position induisent un renforcement de la liaison S-Fe. Ceci a pu être associé à un affaiblissement de la liaison hydrogène entre le NH peptidique des mutants de l'isoleucine 118 et le soufre de la cystéine. Les études de cinétique rapide par radiolyse pulsée ont permis de montrer que les mutations facilitent la protonation des intermédiaires réactionnels de type Fe3+-peroxo et Fe3+-hydroxo. Ces résultats sont en accord avec l'augmentation de densité électronique autour du fer du site actif, qui induit une basicité plus importante de ces intermédiaires réactionnels. Ainsi, nous avons pu montrer que le renforcement de la liaison S-Fe a pour conséquence l'accélération de la réaction de la SOR avec le superoxyde. Le ligand axial cystéine a donc pour rôle de contrôler la densité électronique autour du fer du site actif et ainsi d'influer sur la réduction du superoxyde