Characterization of the proteins required for RNA-mediated heterochromatinization

Abstract

L’hétérochromatine constitutive est typiquement associée à une triméthylation de la lysine 9 de l’histone H3 (H3K9me3), catalysée par la famille d’histone méthyltransférase de type SUV39. Elle est impliquée dans la compaction de la chromatine, nécessaire au maintien des structures chromatiniennes et à l’inhibition des éléments transposables (TEs). L’hétérochromatine facultative, elle, est associée à une trimethylation de la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27me3), laquelle est médiée par le protéines du groupe Polycomb (PcG), et impliquée dans la régulation des gènes. Au sein de l’hétérochromatine constitutive, H3K9me3 est ciblée par de petits ARNs, et un nombre croissant de preuves soutiennent l’idée que les protéines PcG coopèrent elles aussi avec de petits ARNs dans l’établissement de la chromatine facultative. Cependant le mécanisme permettant à ces petits ARNs de conduire les protéines PcG à la chromatine, ainsi que la relation entre ce mécanisme et la formation de l’hétérochromatine via petits ARNs restent incompris. Au cours de cette thèse, j’ai tenté de comprendre comment les protéines PcG contrôlent la formation de l’hétérochromatine en utilisant comme modèle l’élimination programmée d’ADN du cilié Tetrahymena thermophila. Chez Tetrahymena, environ 12.000 segments d’ADN dérivés de TEs sont éliminés du génome germinal lors du développement du noyau somatique. De précédentes études menées au sein de notre laboratoire ont montré que cette élimination est régulée par une formation d’hétérochromatine dirigée par des petits ARNs d’environ 29 nucléotides, complémentaires aux séquences à éliminer, induisant localement l’accumulation de H3K9me3 et H3K27me3. Les régions associées à ces marques sont par la suite éliminées des chromosomes. Le génome de Tetrahymena ne présente aucun homologue à SUV39, et l’accumulation de H3K9me3 et H3K27me3 sont toutes deux dépendantes de Ezl1p, un homologue de la protéine PcG E(z). Ainsi, d’un point de vue mécanique et évolutif, il est intéressant de comprendre comment Ezl1p mène à l’accumulation de H3K9me3 chez Tetrahymena. De plus, chez Tetrahymena, tous les précédents mutants de la formation d’hétérochromatine voient leurs H3K9me3 et H3K27me3 être affectées, et il est incertain si ces marques possèdent des rôles distincts dans l’élimination programmée de l’ADN.Lors de ma thèse, j’ai étudié le gène DNA Elimination Defective 2 (DED2), précédemment identifié comme étant nécessaire à l’élimination programmée d’ADN chez Tetrahymena. Le rôle exact de DED2 n’ayant pas été caractérisé, j’ai analysé la localisation de la protéine qu’il code - Ded2p – par marquage d’épitope du gène endogène. J’ai observé que Ded2p est d’abord localisée dans le noyau somatique parental puis dans le noyau somatique en développement, tout comme de nombreuses autre protéines impliquées dans l’élimination d’ADN. J’ai ensuite co-purifié les protéines interagissant avec Ded2p et identifié Ezl1p ainsi que quelques nouvelles protéines. Ces dernières comprennent des protéines similaires à Suz12, Psc et dRing, suggérant que Ded2p puisse interagir avec un complexe hybride d’homologues de PRC1 et PRC2. Afin de comprendre la fonction de Ded2p, j’ai ensuite produit des lignées knock-out (KO) et pu confirmer que l’absence de DED2 cause une inhibition partielle de l’élimination d’ADN et une perte complète de viabilité des descendants. La biogénèse des ARN en l’absence de DED2 n’était, elle, pas affectée. Curieusement, des marquages par immunofluorescence ont pu montrer que chez les KO DED2, l’accumulation de H3K9me3 était sévèrement affectée alors que celle de H3K27me3 restait inchangée. Ces résultats indiquent que Ded2p renforce vraisemblablement l’activité de Ezl1p et que H3K27me3 seule est insuffisante à l’élimination programmée d’ADN. Le travail présenté ici ainsi que de futures études sur Ded2p devraient éclaircir les mécanismes du complexe Ezl1p ainsi que les rôles de H3K9me3 et H3K27me3 dans l’élimination d’ADN.Constitutive heterochromatin is typically associated with histone H3 lysine 9 tri-methylation (H3K9me3), which is catalyzed by SUV39 family histone methyltransferases (HMTs). It is involved in compaction of chromatin to maintain the chromosome structures and in silencing of Transposable elements (TEs) to preserve genome integrity. On the other hand, facultative heterochromatin is mainly associated with histone H3 lysine 27 tri-methylation (H3K27me3), which is mediated by Polycomb Group (PcG) proteins and involved is gene regulations. Ample studies indicated that H3K9me3 at constitutive heterochromatin is targeted by small RNAs. In addition, increasing evidences support the idea that PcG proteins cooperate with small RNAs for establishing facultative heterochromatin. However, the mechanism leading small RNAs to target PcG on chromatin and its relationship with the small RNA-directed constitutive heterochromatin formation remain unknown. For my PhD project, I aimed to understand how PcG proteins mediate heterochromatin formation, using the programmed DNA elimination process in the ciliated protozoan Tetrahymena thermophila. In Tetrahymena, ~12,000 TE-related DNA segments in the germline genome are removed during the development of somatic nucleus. Previous studies in my host laboratory have shown that DNA elimination in Tetrahymena is regulated by a small RNA-directed heterochromatin formation, in which small RNAs, about 29 nucleotides in length, interact with the sequences to be eliminated and induce accumulation of both H3K9me3 and H3K27me3. The regions associated with these heterochromatin marks are eventually targeted for elimination from the chromosomes. The Tetrahymena genome lacks any SUV39 homologue and the accumulations of both H3K9me3 and H3K27me3 are dependent on Ezl1p, a homolog of the PcG protein E(z). Therefore, from both mechanistic and evolutionary points of views, it is interesting to understand how Ezl1p mediates the accumulation of H3K9me3 in Tetrahymena. In addition, because the all previous Tetrahymena mutants affecting the heterochromatin formation also affect the both modifications, it is still unclear whether H3K9me3 and H3K27me3 have distinct roles in DNA elimination.In my PhD study, I have investigated the DNA Elimination Defective 2 (DED2) gene, that was identified to be important for DNA elimination in Tetrahymena in a previous genetic screening. Because the exact role of DED2 had not been characterized, I first analyzed the localization of Ded2p, the protein encoded by DED2, by epitope tagging at the endogenous DED2 locus. I found that Ded2p localizes first in the parental somatic nucleus and then to the newly developed somatic nucleus, as many other proteins involved in DNA elimination. Then, I identified proteins co-purified with Ded2p and found that Ded2p interacts with Ezl1p and a few previously unidentified proteins. Interestingly, the latter includes proteins similar to Suz12, Psc and dRing, suggesting that Ded2p may interacts with a protein complex that is a hybrid of PRC1 and PRC2. Next, to understand the function of DED2, I produced DED2 knockout (KO) strains. I confirmed that the loss of DED2 causes a partial inhibition of DNA elimination and the complete loss of progeny viability. The biogenesis of the small RNAs were not obviously affected in the absence of DED2. Interestingly, immunofluorescent staining showed that, in the new somatic nucleus of DED2 KO cells, the accumulation of H3K9me3 was severely reduced, while H3K27me3 was accumulated normally. These results indicate that Ded2p likely enhance the H3K9 methyltransferase activity of Ezl1p and that H3K27me3 alone is insufficient for the proper DNA elimination. The work presented here and further investigations of Ded2p should clarify the catalytic mechanism of Ezl1p-complex as well as the roles of the two modifications in DNA elimination