Antimicrobial resistance and pathogenicity of Enterococcus cecorum isolates in France

Abstract

Enterococcus cecorum est une bactérie commensale et dominante dans le tractus intestinal du poulet adulte. Depuis 2002, elle est devenue une cause mondiale de boiteries chez les volailles, particulièrement chez les poulets de chair à croissance rapide. Cette bactérie est principalement responsable de spondylarthrite, mais aussi de nécrose de la tête fémorale et d’ostéomyélite. Ainsi, les infections à E. cecorum engendrent une souffrance animale et contribuent à l'utilisation d'antibiotiques, susceptibles d’entraîner des résistances. La pathogénicité d‘E. cecorum est peu étudiée et rares sont les données disponibles concernant la résistance aux antimicrobiens dans les isolats cliniques français.Dans un premier temps, nous avons analysé la diversité génétique de cette espèce et en particulier des isolats cliniques circulant dans les élevages français. Pour cela, l'étude génomique de 118 isolats d’origine principalement clinique a été réalisée. Le séquençage, l'assemblage et l'annotation de ces génomes ont permis de caractériser le core et le pan-génome de cette espèce. Les isolats cliniques semblent phylogénétiquement distincts des isolats non cliniques de volailles et forment un clade principal responsable des infections à E. cecorum en France et probablement aux Etats-Unis et en Europe. De plus, des gènes enrichis dans les génomes d'isolats cliniques ont été mis en évidence et nous avons identifié six gènes qui permettraient de déterminer l'origine clinique d'une souche dans 94% des cas. La recherche de gènes de résistance aux antibiotiques a également permis de montrer que les ICE ou îlots génomiques en sont les principaux supports génétiques.Dans un second temps, nous avons enrichi la collection avec des isolats non-cliniques isolés d’élevages français afin d’étudier les phénotypes de résistance aux antimicrobiens et déterminer les premiers seuils épidémiologiques pour la diffusion en gélose à partir de disques (DD) ou la micro-dilution en milieu liquide (MDL). Après avoir optimisé ces méthodes pour E. cecorum, nous avons déterminé des seuils pour 25 ou 20 molécules testées par DD ou MDL respectivement. Les résistances aux tétracyclines ou à certains macrolides-lincosamides-streptogramines sont fréquentes alors que les résistances aux antibiotiques d’importance en santé humaine sont rares. La confrontation des données phénotypiques avec les génomes précédemment étudiés a montré une meilleure corrélation entre la méthode DD et les gènes de résistance identifiés. Nous avons également mis en évidence des mutations pouvant être à l'origine de résistances aux fluoroquinolones.Enfin, nous avons réalisé un essai in vivo chez le poulet pour étudier la colonisation digestive et la sélection d’une souche clinique d'E. cecorum résistante à de nombreux antimicrobiens, en particulier aux glycopeptides et au narasin. Des poussins d'un jour ont été inoculés oralement avec cette souche et traités ou non par différents antimicrobiens dont la tétracycline ou le narasin. L’analyse des matières fécales a montré la persistance de la souche, mais celle-ci n’a pas été sélectionnée par l’administration de tétracycline ou de narasin. De plus, dans nos conditions, le transfert de la résistance à la vancomycine de la souche inoculée vers un autre entérocoque du microbiote intestinal n’a pas été détecté.L’ensemble des résultats de cette thèse mettent en évidence une clonalité des souches cliniques circulant en élevage en France, renseignent sur leur résistance aux antimicrobiens et permettent de proposer les premiers seuils épidémiologiques de résistanceEnterococcus cecorum is a commensal and dominant bacterium in the intestinal tract of adult chickens. Since 2002, it has become a worldwide cause of lameness in poultry, particularly in fast-growing broilers. This bacterium is mainly responsible for spondylarthritis, but also for femoral head necrosis and osteomyelitis. E. cecorum infections cause animal suffering and contribute to the use of antibiotics, which may lead to resistance. The pathogenicity of E. cecorum is poorly studied and few data are available on antimicrobial resistance in French clinical isolates.First, we analysed the genetic diversity of this species and in particular the clinical isolates circulating in French farms. For this purpose, the genomic study of 118 isolates of mainly clinical origin was carried out. The sequencing, assembly and annotation of these genomes have made it possible to characterise the core and pan-genome of this species. Clinical isolates appear phylogenetically distinct from non-clinical poultry isolates and form a main clade responsible for E. cecorum outbreaks in France and probably in the USA and Europe. In addition, genes enriched in the genomes of clinical isolates have been identified and we have selected six genes that discriminate 94% of isolates associated with disease from those that are not. The search for antibiotic resistance genes also showed that the ICEs or genomic islands are the main genetic carriers.In a second step, we enriched the collection with non-clinical isolates isolated from French farms to study antimicrobial resistance phenotypes and determine the first epidemiological cut-off for agar disc diffusion (DD) or broth microdilution (BM). After optimising these methods for E. cecorum, we determined cut-offs for 25 or 20 molecules tested by DD or BM respectively. Frequent resistances to tetracyclines or some macrolides-lincosamides-streptogramines were highlighted, whereas resistances to antibiotics of importance in human health are rare. The comparison of phenotypic data with the previously studied genomes showed a better correlation between the DD method and the resistance genes identified. We also highlighted mutations that could be at the origin of fluoroquinolone resistance.Finally, we performed an in vivo trial in chickens to study the digestive colonisation and selection of a clinical strain of E. cecorum resistant to numerous antimicrobials, in particular glycopeptides and narasin. One-day-old chicks were orally inoculated with this strain and treated or not with different antimicrobials including tetracycline or narasin. Faecal analysis showed the persistence of the strain, but it was not selected by the administration of tetracycline or narasin. Furthermore, in our conditions, transfer of vancomycin resistance from the inoculated strain to another Enterococcus in the gut microbiota was not detected.Altogether, the results of this thesis highlighted the clonality of the clinical strains circulating in livestock in France, determined their resistance to antimicrobials and proposed the first epidemiological thresholds of resistance