Gómez Lugo, Jessica Judith

Zárate Kalfópulos, Xristo

Repositorio Academico Digital UANL

V Simposio Nacional de   Ciencias Farmacéuticas y Biomedicina  III Simposio Nacional de Microbiología Aplicada  76 RCFB, Ed. Esp. 2, 2018  Abril 26 y 27 2018  CusF3H+_Miraculin (32.07 kDa) Producción de Proteínas Recombinantes Dulces y Modificadoras del Sabor en Escherichia coli   Jessica J. Gómez-Lugoa, Xristo Zárate Kalfópulosa* a Universidad Autónoma de Nuevo León. Facultad de Ciencias Químicas, Pedro de Alba s/n, San Nicolás de los Garza, México.  * xristo.zaratekl@uanl.edu.mx.  Palabras clave: Brazzein, Miraculin, Proteína de fusión, Enlaces disulfuro, E. coli. Introducción En la naturaleza existen proteínas con actividad dulce y modificadora del sabor; un ejemplo son Brazzein y Miraculin. Estas proteínas han demostrado poseer una actividad de 500–200 veces y de 3000 veces más dulce que la sacarosa la cual les brinda potencial para ser utilizadas como sustitutos de azúcar con poco aporte calórico y por lo tanto pueden ser utilizadas en alimentos, bebidas y medicinas1. Una de las principales características estructurales que poseen es la presencia de enlaces disulfuro, los cuales aseguran su actividad además de brindarles estabilidad2. En bacterias, la formación de estos enlaces se lleva a cabo en el periplasma, ya que es un compartimiento oxidante que almacena las enzimas encargadas de la formación del enlace disulfuro y de su isomerización así como chaperonas y enzimas de plegamiento3. Por otra parte, el citoplasma bacteriano al ser un compartimento reductor no posee las enzimas necesarias para la formación de este tipo de enlaces4. Para eludir este problema una variedad de cepas modificadas han sido producidas, las cuales tienen una interrupción total o parcial de una o ambas vías implicadas en asegurar que el citoplasma sea un ambiente reductor4 y además cuentan con la disulfuro isomerasa DsbC que se encarga del correcto plegamiento de los enlaces disulfuro5. El objetivo de este proyecto es utilizar a la bacteria E. coli como una fábrica celular microbiana para la expresión en el citoplasma de proteínas complejas con múltiples enlaces disulfuro mediante el uso de proteínas de fusión como CusF3H+ la cual permitirá la mejora en el proceso de purificación aumentando la pureza de la proteína obtenida6. Además, el desarrollo de nuevas tecnologías de expresión y purificación de proteínas dulces y modificadoras del sabor permitirá la obtención de nuevos productos que pueden ser utilizados en la industria alimenticia y farmacéutica. Parte experimental La metodología comienza por la síntesis del gen de interés y su posterior clonación en E. coli DH5α utilizando el plásmido pET30a_CusF3H+. Una vez completa la clonación, la construcción se transforma en la cepa de expresión E. coli SHuffle T7 express. La expresión de la proteína de interés se verifica por SDS-PAGE. Para la purificación se utiliza IMAC e Intercambio Aniónico y una vez que se remueve la proteína de fusión de la proteína de interés se evalúa la actividad de las proteínas.  Resultados y discusión Para la microexpresión de CusF3H+_Miraculin y CusF3H+_Brazzein se tomaron en cuenta los las condiciones probadas por Vargas-Cortez (2017), además los resultados muestran que el uso CusF3H+ como proteína de fusión permite la obtención de proteína altamente soluble (Figura 1) y facilita la etapa de purificación (Figura 2) al utilizar IMAC Ni(II).  Figura 1. Microexpresión de CusF3H+_Brazzein (17.09kDa) y CusF3H+_Miraculin (32.07kDa) mediante SDS-PAGE al 15%.   Figura 2. Purificación por IMAC Ni(II) y análisis de fracciones de elución de CusF3H+_Brazzein (17.09kDa) mediante SDS-PAGE 15%.   Debido a que se pretende que la proteína Brazzein sea una alternativa de edulcorante natural para los humanos, la inocuidad de la proteína es necesaria. Tomando en cuenta lo anterior se llevó a cabo una cromatografía de intercambio aniónico para la remoción de endotoxinas. CusF3H+_Brazzein al tener una caga negativa compite con las endotoxinas por los sitios de unión, los cuales eventualmente se saturan. Aquellas proteínas que no interaccionan con la resina, capturan a las endotoxinas y por lo tanto eluyen de la columna, permitiendo la obtención de proteína libre de endotoxinas7. Conclusiones Se obtuvo la correcta expresión en E. coli de las proteínas CusF3H+_Brazzein y CusF3H+_Miraculin, puesto que se observa la aparición de nuevas bandas que corresponden al peso molecular deseado. Se logró la purificación de la proteína CusF3H+_Brazzein mediante cromatografía por afinidad a Ni(II). 50mM TRIS, 500 mM NaCl, 5mM Imidazol como solución amortiguadora de lisis, 50mM TRIS, 500 mM NaCl, 10mM Imidazol como solución amortiguadora de lavado y 50mM TRIS, 500 mM NaCl, 200mM Imidazol como solución amortiguadora de elución. Finalmente se purificó la proteína CusF3H+_Brazzein mediante cromatografía de intercambio aniónico, permitiendo la obtención de proteína altamente pura.  Referencias 1. Jo, H. J. Protein Expr. Purif. 2013, 90, 84-89 2. Sato, Y. & Inaba, K. FEBS J. 2012, 279, 2262–2271. 3. de Marco, A. Microb. Cell Fact. 2009, 8, 26-44. 4. Hatahet, F., Ruddock, L. W. Microb. Cell Fact. 2010, 9, 67-76 5. Lobstein, J. et al. Microb. Cell Fact. 2012, 11, 56-72 6. Vargas-Cortez T. & Zarate, X. Protein Expr. Purif. 2017, 132, 44–49 7. Ongkudon, C. M. ISRN Chromatogr. 2012, 1-9 CusF3H+_Brazzein (17.09 kDa) 

Producción de proteínas recombinantes dulces y modificadoras del sabor en escherichia coli.

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