Balderas Rentería, Isaías

González González, María del Rosario

Martínez Mora, Evelyn

Zárate Kalfópulos, Xristo

Repositorio Academico Digital UANL

V Simposio Nacional de   Ciencias Farmacéuticas y Biomedicina  III Simposio Nacional de Microbiología Aplicada 77 RCFB, Ed. Esp. 2, 2018  Abril 26 y 27 2018  Producción extracelular de glucosa oxidasa recombinante por Pichia pastoris Evelyn Martínez Mora1*, María del Rosario González González1, Xristo Zárate Kalfópulos1, Isaías Balderas Rentería1 1Universidad Autónoma de Nuevo León, División de Estudios de Posgrado de la Facultad de Ciencias Químicas, Guerrero s/n, Treviño, C.P. 64570 Monterrey, Nuevo León México. *evelyn_mtzm@hotmail.com Palabras clave: glucosa oxidasa, Pichia pastoris, electroporación  Introducción La glucosa oxidasa (GOx) es una enzima que en presencia de glucosa y oxígeno forma H2O2 y ácido glucónico. Tiene un amplio uso a nivel industrial y comercial, como aditivo en el procesamiento de los alimentos por sus funciones como antioxidante y conservador, para disminuir la concentración de alcohol en la producción de vinos, como biosensor en los dispositivos para la medición de los niveles de glucosa, entre otras. Dos de las especies de hongos que producen GOx son Aspergillus niger y Penicillium amagasakiense, esta última cataliza la oxidación de la glucosa más eficientemente1,2. En este trabajo se expresó la enzima glucosa oxidasa recombinante (GOxr) producida extracelularmente por Pichia pastoris, se modificó y optimizó el gen gox de A. niger para mejorar su expresión en la levadura y su actividad catalítica. Parte experimental Para el diseño del gen goxM se tomó solo la región de DNA que codifica a la enzima madura, a esta secuencia se le cambiaron los codones que codifican una Thr por una Ser de la posición 132 y una Thr por una Val de la posición 56 de la secuencia de aminoácidos con la clave AID13306.1. Al inicio de la cadena se le añadió la secuencia de DNA que codifica la señal de secreción del factor α. Se amplificó el gen y se le realizó una doble digestión enzimática con las enzimas BamHI y NotI, al igual que al vector pPIC3.5K. La reacción de ligación se llevó a cabo con un relación molar vector:inserto de 1:3 utilizando la enzima T4 DNA Ligasa. Se transformaron células de E. coli DH5α rubidio competentes con el plásmido construido pPIC3.5K-goxM para su propagación. Posteriormente se realizó una digestión enzimática del plásmido pPIC3.5K-goxM para linearizarlo con la enzima SacI y transformar por electroporación, con 10 µg de plásmido, células de P. pastoris SMD1168 electro-competentes; se realizó el choque eléctrico con las siguientes condiciones: 2500 V, 25 µF y 200 Ω;  las células se cultivaron en medio selectivo mínimo de dextrosa  a 30°C; una vez obtenidas, se les realizó la extracción de DNA genómico con TSNT para posteriormente llevar a cabo una PCR y confirmar la integración del plásmido en el genoma de P. pastoris; se utilizó la enzima Dream Taq DNA polimerasa y los primers 5’AOX1 Forward y 3’AOX1 Reverse. Para la expresión se seleccionaron dos clonas portadoras del gen, se crecieron por separado en el medio enriquecido amortiguado adicionado con glicerol a 30 °C con agitación de 250 rpm, y posteriormente se transfirieron las células al medio enriquecido amortiguado adicionado con metanol. Se tomaron muestras del medio a las 48 h, 72 h y 96 h para ser analizadas por SDS-PAGE. Resultados y Discusión En el gel de agarosa al 1 % de la figura 1 se observa en los carriles 4 – 6, correspondientes al DNA de P. pastoris transformada con el plásmido pPIC3.5K-goxM, una banda gruesa entre 2323 pb y 1929 pb, debido a que se encuentran solapadas o muy próximas dos bandas, de las cuales una de ellas es de 2210 pb correspondiente al amplicón del SMC del plásmido pPIC3.5K-goxM integrado al genoma de la levadura y la otra corresponde al amplicón de 2200 pb del gen AOX1 de P. pastoris, lo que nos indica que esta cepa es Mut+, que se amplifica con los primers 5’AOX1 Forward, la cual se aparea en una región del promotor de este gen y 3’AOX1 Reverse que se aparea a una región del terminador de la transcripción de dicho gen, y esta banda es observada en el carril que corresponde a la transformación de la levadura con el vector pPIC3.5K junto con otra banda de 221 pb que corresponde al amplicón del SMC de este vector3,4. Figura 1. Análisis de la integración de pPIC3.5K-goxM al genoma de P. pastoris SMD1168. Electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Carril 1: Marcador de peso molecular ʎ DNA/BstEII. Carril 2: Control positivo del amplicón del SMC del plásmido pPIC3.5K-goxM. Carril 3: P. pastoris transformada con pPIC3.5K. Carril 4-6: P. pastoris transformada con pPIC3.5K-goxM.  En el gel de poliacrilamida al 11 % de la figura 2 se observa en los carriles 4 – 9, correspondientes al medio de cultivo de P. pastoris portadora del gen goxM, una banda gruesa entre 75 kDa y 50 kDa, esta banda no se encuentra en los carriles 2 y 3 que corresponden al medio de cultivo utilizado como control negativo de P. pastoris transformada con el vector pPIC3.5K5. Figura 2. Análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida al 11 % de la expresión de GOxr. Carril 1: Marcador de peso molecular. Carril 2 y 3: Cultivo de 72 h y 96 h de expresión de P. pastoris transformada con pPIC3.5K. Carril 4-6: Cultivo de 48 h, 72 h y 96 h de la clona 1 de P. pastoris portadora del gen goxM. Carril 7-9: Cultivo de 48 h, 72 h y 96 h de la clona 2 de P. pastoris portadora del gen goxM. V Simposio Nacional de   Ciencias Farmacéuticas y Biomedicina  III Simposio Nacional de Microbiología Aplicada 78 RCFB, Ed. Esp. 2, 2018  Abril 26 y 27 2018  Conclusiones Se obtuvieron cepas de Pichia pastoris SMD1168 portadoras del gen goxM. Se logró la expresión de la glucosa oxidasa recombinante, con un peso molecular que se encuentra entre 63 – 75 kDa. Referencias 1. Wong CM, Wong KH, Chen XD. Appl Microbiol Biotechnol. 2008;78(6):927-938. 2. Bankar SB, Bule M V, Singhal RS, Ananthanarayan L. Biotechnol Adv. 2009;27(4):489-501. 3. Daly R, Hearn MTW. J Mol Recognit. 2005;18(2):119-138. 4. Schwarzhans J, Wibberg D, Winkler A, Luttermann T. Nat Publ Gr. 2016:1-12. 5. Qiu Z, Guo Y, Bao X, et al. Biotechnol Biotechnol Equip. 2016;30(5):998-1005. 

Producción extracelular de glucosa oxidasa recombinante por Pichia pastoris.

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