Oral cancer is increasingly recognized as two distinct diseases, mouth and oropharyngeal
cancer. Its incidence and mortality are increasing, and it is expected in the year of 2040
a number of 553000 new cases and a total of 263000 deaths, worldwide. Treatment
options depend on the stage of cancer, the location of the tumor, patient age, associated
illnesses, among others. The most common therapy for oral cancers in early stages is
surgery, to remove the top layers of malignant tissue. In more advanced stages, when
there is still no metastasis, the most used therapies are surgery and radiotherapy, either
used alone or combined. When the cancer has already spread to other parts of the body,
a combined modality approach integrating surgery, and radiotherapy with or without
chemotherapy is the golden choice. For some patients, immunotherapy, alone or with
chemotherapy can be also an option. Although there are several therapeutic options,
none of them are completely effective and in addition, there are several side effects
associated with the therapies. To overcome these limitations, researchers have been
trying to reduce these drawbacks by using drug delivery systems that carry drugs to be
delivered at cancer cells.
In this dissertation, we synthesized, characterized, and evaluated the biological potential
of nanoparticles, namely liposomes and gold nanoparticles, coated with a RNA to
selectively deliver the ligands C8, and dexamethasone, to oral cancer cells.
Firstly, the RNA structure and binding interaction between the RNA sequence and
ligands C8, dexamethasone and nucleolin (NCL) were evaluated by CD, TDS, NMR and
fluorescence titrations. The biophysical assays evidenced the formation of an RNA
hairpin and duplex structure and the ligands C8 and dexamethasone did not stabilize this
structure. It was also shown that the RNA interacts and has a KD to NCL of 1.8 × 10-6 M,
which increases with the addition of C8 and dexamethasone, and C8 showing a more
pronounced effect.
Then, RNA-coated gold nanoparticles and liposomes were produced and characterized.
The functionalized gold nanoparticles and liposomes presented a size close to 20 nm and
160 nm, respectively, as observed by the DLS technique. The PAGE and NMR techniques
showed that the liposomes were effectively coated with the RNA. Additionally, the UVvis spectroscopy revealed that the ligands C8 and dexamethasone were efficiently
encapsulated in the liposomes.
Finally, in vitro effects on oral cancer cell line (SCC-154) versus healthy cells (NHDF) of
RNA gold nanoparticles and liposomes loading the ligands C8 and dexamethasone and
the capacity of internalization of the RNA on oral cancer cells were evaluated. By MTT assay the RNA functionalized liposomes loaded with C8, or dexamethasone presented a
significant reduction in the cell viability of malignant SCC-154 cells, while maintaining
viable the non-malignant NHDF cells. With respect to the confocal fluorescence
microscopy assays, the results proved that the RNA was able to internalize the majority
of SCC-154 cells after 2 h of incubation, and mainly localize the nucleus and cytoplasm
of cells. We also verified that the RNA did not internalize cells via NCL.
Overall, the results obtained in this dissertation can contribute to the development of
new drug delivery systems for sustained and effective targeted oral cancer therapy.O cancro oral é cada vez mais reconhecido como duas doenças distintas, o cancro da boca
e da orofaringe. A sua incidência e mortalidade estão a aumentar, e espera-se no ano de
2040 553000 novos casos e um total de 263000 mortes, em todo o mundo. As opções
terapêuticas dependem do estadio da doença, da localização do tumor, dos resultados
cosméticos e funcionais, da idade, doenças associadas, entre outras. Para cancros em
estadios iniciais, a terapia mais comum é a cirurgia, com o intuito de remover as camadas
superiores de tecido maligno. Em fases mais avançadas, e quando ainda não existe
metastização, as terapias mais utilizadas são a cirurgia e a radioterapia, isoladamente ou
combinadas. Nos casos em que já ocorreu metastização, é usada uma abordagem
combinada, integrando cirurgia e radioterapia com ou sem quimioterapia. Para alguns
doentes, a imunoterapia, isolada ou com quimioterapia, pode ser uma opção. Embora
existam várias opções terapêuticas, nenhuma delas é completamente eficaz e, além disso,
existem vários efeitos secundários negativos associados. Para ultrapassar estas
limitações, têm sido desenvolvidos sistemas de entrega de fármacos dirigidos para um
determinado alvo com o intuito de melhorar a eficácia da entrega destas moléculas nas
células cancerígenas.
Assim, nesta dissertação, procedeu-se à sintetese, caracterização e avaliação do potencial
biológico de nanopartículas, nomeadamente lipossomas e nanopartículas de ouro,
revestidas com RNA, para a entrega seletiva dos ligandos C8, e dexametasona, às células
do cancro oral.
Em primeiro lugar, a estrutura do RNA e a sua interação com os ligandos C8,
dexametasona e a proteína nucleolina (NCL) foram avaliadas por CD, TDS, NMR e
titulações por fluorescência. Os ensaios biofísicos evidenciaram que o RNA adota uma
estrutura em hairpin e duplex e que os ligandos C8 e dexametasona não estabilizaram a
sua estrutura. Foi também demonstrado que o RNA interage e tem um KD para a proteína
NCL de 1.8 × 10-6M, e que a afinidade aumenta com a adição de C8 e dexametasona, com
um efeito mais pronunciado por parte do ligando C8.
Seguidamente foram produzidas e caracterizadas as nanopartículas de ouro e lipossomas
revestidos com RNA. As nanopartículas de ouro e os lipossomas funcionalizados
apresentaram um tamanho próximo de 20 nm e 160 nm, respetivamente, como
observado pela técnica de DLS. As técnicas de PAGE e NMR mostraram que os
lipossomas e nanopartículas de ouro foram efetivamente revestidos com o RNA. Além
disso, a espetroscopia UV-vis revelou que os ligandos C8 e dexametasona foram
encapsulados nos lipossomas Por último, foram avaliados os efeitos in vitro das nanopartículas de ouro e lipossomas
revestidos com RNA e que carregam os ligandos C8 e dexametasona na linha celular do
cancro oral (SCC-154) versus células saudáveis (NHDF). Foi também avaliada a
capacidade de internalização do RNA em células do cancro oral. Pelo ensaio de MTT, os
lipossomas funcionalizados com RNA e que carregam C8, ou dexametasona,
apresentaram uma redução significativa na viabilidade celular das células malignas SCC154, mantendo ao mesmo tempo viáveis as células não malignas NHDF. Relativamente
aos ensaios de microscopia de fluorescência confocal, os resultados provaram que o RNA
foi capaz de internalizar a maioria das células SCC-154 após 2 h de incubação, e
localizando-se principalmente no núcleo e citoplasma das células. Verificou-se também
que o RNA não internalizou as células através da NCL.
Resumidamente, os resultados obtidos nesta dissertação podem contribuir para o
desenvolvimento de novos sistemas de administração de fármacos para uma terapia do
cancro oral orientada de forma sustentada e eficaz
