β-lapachone induces growth inhibition and apoptosis in bladder cancer cells by modulation of BCL-2 family and activation of caspases

Abstract

Aim: To study in vitro the molecular mechanism of apoptosis caused by b-lapachone, a quinone obtained from the bark of the lapacho tree (Tabebuia avellanedae). Materials and Methods: The study was carried out on human bladder carcinoma T24 cell line. Determination of cell viability was done using trypan blue exclusion method, apoptosis quantitative estimation — by DAPI staining and agarose gel electrophoresis for DNA fragmentation. Flow cytometry analysis, RT-PCR and Western blot analysis, colorimetric assay of caspase activity were applied as well. Results: It was found that in micromolar range of concentrations b-lapachone inhibited the viability of T24 cells by inducing apoptosis, which could be proved by formation of apoptotic bodies and DNA fragmentation. Treatment of T24 cells with b-lapachone resulted in a down-regulation of Bcl-2 expression and up-regulation of Bax expression. b-lapachone-induced apoptosis was also associated with activation of caspase-3 and caspase-9, inhibition of IAP expression, and degradation of poly (ADP-ribose) polymerase, phospholipase C-g1 and b-catenin proteins. At the same time Fas and FasL levels were inhibited upon treatment with b-lapachone in a concentration-dependent manner. Conclusion: b-lapachone-induced apoptosis in T24 cells is mediated, at least in part, by the mitochondrial-signaling pathway.Цель: изучить механизмы апоптоза клеток карциномы мочевого пузыря человека Т24 при действии β-лапакона, хинона из коры дерева Tabebuia avellanedae. Материалы и методы: для определения жизнеспособности клеток использовали окраску трипановым синим; окрашивание DAPI и электрофоретический анализ фрагментации ДНК в агарозном геле, метод проточной цитометрии (для количественной оценки апоптоза); полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (РВ-ПЦР) и Вестерн блот-анализ (для оценки уровня экспрессии генов и белков), а также колориметрический анализ активности каспаз. Результаты: выявлено, что в микромолярных концентрациях β-лапакон понижает жизне- способность клеток линии Т24 путем активации апоптоза, что подтверждается формированием апоптотических тел и фрагментацией ДНК. Результаты РВ-ПЦР и иммуноблоттинга указывают на то, что обработка клеток β-лапаконом приводит к снижению экспрессии Bcl-2 и к активации Bax. Апоптоз, индуцированный β-лапаконом, также сопровож- дается активацией каспаз -3­­ и -9, ингибированием экспрессии семейства IAP, а также деградацией поли-(ADP-рибозо) полимеразы, фосфатазы C-γ1 и β-катенина. Тем не менее, уровень экспрессии Fas и FasL снижался при увеличении концентрации β-лапакона. Выводы: апоптоз, индуцированный при действии β-лапакона в клетках Т24, может быть час- тично опосредован митохондриальным сигнальным каскадом