COUTINHO, H. L. C.

HOLANDA, L. M. de

MANFIO, G. P.

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Caracterização de rizóbios através de perfis de crescimento emcarboidratos. Luciana M. de Hollanda1, Heitor L.C. Coutinho2 e Gilson P. Manfio1.1Fundação Tropical de P.T. André Tosello, Rua Latino Coelho 1301, Campinas - SP;2CNPMA-EMBRAPA, Rod. SP-340 Km 127, Jaguariúna - SP. (heitor@bdt.org.br)Palavras-chave: rizóbio, taxonomia microbiana, crescimento, carboidratos, diversidadeIntroduçãoDentre os microrganismos de solos de grande importância para a agricultura estão aquelescapazes de fixar o nitrogênio atmosférico, aumentando a disponibilidade deste nutrientepara as plantas. A fixação biológica de nitrogênio talvez seja o processo mais relevantedentro da ciclagem global de nitrogênio (Ishizuka, 1992), além de ser fundamental parasistemas de agricultura sustentável, já que em alguns casos, como a soja, pode suprir todo onitrogênio requerido para a obtenção de alta produtividade sem a necessidade de insumosquímicos, reduzindo os danos ambientais causados pela lixiviação dos nitratos (Boddey etal., 1984).As bactérias fixadoras de nitrogênio mais estudadas pertencem à família Rhizobiaceae(Rhizobium, Bradyrhizobium e Azorhizobium; referidos genericamente como rizóbios), esão capazes de estabelecer uma relação de simbiose com espécies de leguminosas. Esteprocesso simbiótico caracteriza-se pela formação de nódulos nas raízes ou caules dasleguminosas infectadas pelas bactérias, onde estas passam a reduzir o nitrogênioatmosférico (N2) para amônio (NH4+), forma assimilável pela planta. Esta simbioseapresenta a característica da especifidade, ou seja, cada espécie de leguminosa é capaz deser nodulada por determinadas espécies ou estirpes de rizóbios.A fixação biológica de nitrogênio (FBN) através da simbiose rizóbio-leguminosa tem sidoamplamente usada e estudada na agricultura, sendo que muitas linhagens de rizóbio já estãodisponíveis para inoculação de plantações de interesse comercial como soja, grão-de-bico,ervilha-de-vaca, amendoim, tremoço, alfafa, trevo (Döbereiner & Duque, 1980; Dreyfus etal., 1988).A diversidade destes microrganismos constitui importante fonte de recurso genético paraseleção de linhagens a serem usadas como novos inoculantes, não apenas em plantaçõescomerciais como também na revegetação de solos de baixa fertilidade, erodidos oudegradados. Estudos recentes, embora escassos, têm demonstrado a enorme diversidade derizóbios presentes em solos tropicais. Ahmad et al. (1981) empregaram técnicas deimunologia para examinar 53 linhagens de rizóbios isolados de leguminosas em três regiõesdiferentes da África Ocidental. Os resultados encontrados demonstraram grandediversidade de serotipos de rizóbios nas populações naturais das três regiões. Já Zhang etal. (1991) usaram taxonomia numérica para estudar a diversidade de linhagens de rizóbiosisoladas de leguminosas arbóreas, Acacia senegal e Prosopis chilensis, no Sudão. Osresultados evidenciaram um alto grau de diversidade entre os rizóbios arbóreos do Sudão,os quais mostraram-se todos de crescimento rápido. Num estudo mais amplo, 171linhagens de rizóbios, das quais 120 de crescimento lento, foram analisadas através deeletroforese de proteínas totais em gel de poliacrilamida-SDS (Moreira et al., 1993). Estaslinhagens foram selecionadas de um total de 800, isoladas de leguminosas tropicais daFloresta Amazônica e Mata Atlântica no Brasil, de maneira a representar tipos culturaisdiferentes de grupos de divergência diferentes de Leguminosae. Linhagens tipo e referênciaapropriadas e também 7 linhagens tropicais isoladas de Phaseolus vulgaris foram incluídasnas análises para comparação. Vinte e três grupos eletroforéticos foram obtidos, sendo quea maioria dos isolados de crescimento lento (92 de 120) formou um grupo que continha alinhagem tipo de B. japonicum. Portanto, os perfis de proteínas dos rizóbios de crescimentorápido evidenciaram uma diversidade genética maior que a encontrada para os rizóbios decrescimento lento. Os autores não observaram nenhuma correlação entre os gruposeletroforéticos obtidos e os grupos de divergência de Leguminosae dos quais as linhagensforam isoladas. Resultado semelhante foi observado em padrões de bandas resultantes deanálises de RAPD (Coutinho et al., não publicado). Quarenta destas linhagens foramselecionadas para sequenciamento de um fragmento de seus rDNA 16S. Foi constatado opotencial para a descrição de novas espécies de rizóbio a partir destas linhagens, havendo,para isso, a necessidade de caracterizações mais diversificadas, abrangendo característicasfisiológicas, como a capacidade de metabolizar fontes diferenciads de carbono e nitrogênio(F. Moreira, inf. pessoal).MetodologiaSessenta e cinco linhagens de rizóbio das 171 caracterizadas por Moreira et al. (1993)foram selecionadas para estudo, incluindo as linhagens-tipo e referência das espécies jádescritas na literatura.As linhagens, mantidas em meio YMA (manitol-ext. de levedura) foram inicialmenteinoculadas em meio TY(triptona-levedura), para crescimentyo até a fase logarítmica. Ascélulas coletadas e lavadas foram resuspendidas em meio MOPS com concentração celularpadronizada, na ausência de qualquer açúcar, para ocorrer a derepressão de todas as viasmetabólicas.Os testes de utilização de fontes de carbono foram realizados em placas multipoços do tipo“Elisa” com os seguintes açúcares:ManitolGlicoseSacaroseLactoseArabinoseFrutoseGalactoseInusitolCelobioseAdonitolAcetato de sódioCitratoSorboseGlicerolMaltoseAs linhagens foram inoculadas em duplicata nos diferentes açúcares com um controle semfonte de carbono. Cada açúcar também correspondeu a um controle sem inoculação. Asplacas foram incubadas a 28°C durante todo o tempo de análise. As leituras foram feitaspelo leitor de placas automatizado 340 ATTC (STI). Para cada poço foi desenhada umacurva de crescimento que foram então comparadas quanto a: 1) utilização do açúcar; 2)velocidade de crescimento; e 3) alcalinização ou acidificação do meio (através do uso doindicador de pH azul de bromotimol).Resultados e ConclusãoOs resultados obtidos com as curvas de crescimento (Figura 1) foram utilizados paraelaborar um dendrograma de similaridade entre as linhagens. A utilização de fontes decarbono não foi suficiente para discriminar as linhagens a nível intra-específico sendonestes casos relevante a determinação da inclinação da curva de crescimento (velocidade decrescimento). Na figura 1, note como é possível agrupar as estirpes BR322 e BR817 emfunção de suas velocidades de crescimento, com as estirpes BR7605 e BR7606 formandooutro grupo de velocidade menor. Foi possível a análise de até 6 linhagens e 7 açúcares porplaca, o que simplificou todo o processo. O uso do leitor automatizado de placaspossibilitou a construção das curvas de crescimento das 6 linhagens por placasimultaneamente.Figura 1. Crescimento de 5 linhagens de Rhizobium em duas fontes de carbono (manitol esacarose).SACAROSE1101000 10 20 30 40 50 60TempoLog D.O. ControleBR 322BR 817BR 7605BR 7606BR 7801Manitol1101000 2 4 6 8 10121416182022242628303234363840424446485052Tempo (horas)Log D.ONuma abordagem polifásica, os resultados serão comparados com as caracterizaçõespreviamente realizadas para estas mesmas linhagens (RAPD, MLEE, perfil de resistência àantibióticos, SDS-PAGE, e caracterização morfológica).Referências BibliográficasAhmad, M.H. et al. (1981). Archives of Microbiology 130:281-287.Boddey, R.M. et al. (1984). Soil Biology and Biochemistry 16:583-589.Dreyfus, B. et al. (1988). International Journal of Systematic Bacteriology 38:89-98.Ishizuka, J. (1992). Plant and Soil 141:197-209.Moreira, F.M.S. et al. (1993). Systematic and Applied Microbiology 16:135-146.Zhang, X. et al. (1993). International Journal of Systematic Bacteriology 41:104-113.

Caracterização de rizóbios através de perfis de crescimento em carboidratos.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/1151751/1/1996PC-Coutinho-Caracterizacao-.pdf

Caracterização de rizóbios através de perfis de crescimento em carboidratos.

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