VEGF-A directly impacts immune system in tumor microenvironment : modulative effects by anti-angiogenic treatments

Abstract

L'évolution d'une cellule humaine vers une cellule tumorale est dépendante de l'acquisition successive d'anomalies leur conférant un avantage de croissance et leur permettant une expansion clonale. Parmi ces anomalies, la capacité d'échapper à la surveillance continue du système immunitaire s'est révélée être indispensable. Pour y aboutir, les cellules tumorales développent différents mécanismes parmi lesquels l'instauration d'un microenvironnement immunosuppresseur favorisant l'accumulation de cellules immunorégulatrices, telles que les lymphocytes T régulateurs(Treg), ainsi que l'inhibition des fonctions des lymphocytes T CD8+ effecteurs. Cette perte de fonction, appelée "exhaustion" ou épuisement, passe notamment par l'expression à leur surface de molécules de co-stimulation inhibitrices telles que PD-1, Tim3, CTLA4 et LAG3. Au sein de ce microenvironnement tumoral, le vascular endothelial growth factor (VEGF)-A a longtemps été étudié pour ses propriétés pro-angiogéniques, aboutissant au développement de traitements anti-angiogéniques. Cependant, le VEGF-A possède également des propriétés immunomodulatrices favorisant l'échappement des cellules tumorales à la surveillance par le système immunitaire en inhibant la maturation des cellules dendritiques, en induisant l'accumulation de cellules myéloïdes suppressives (MDSC) et en favorisant l'accumulation de Treg en périphérie. Mais l'action directe du VEGF-A sur les lymphocytes T CD8+ et Treg infiltrant la tumeur, n'a jamais été étudiée. L'objectif de ce travail était donc d'évaluer l'effet directe de la voie VEGF-A/VEGFR sur les lymphocytes cytotoxiques CD8+ mais également les Treg intratumoraux, tout d'abord dans des modèles précliniques murins puis chez l'homme. Dans un premier temps, nous avons montré, dans un modèle murin, que le VEGF-A, présent au sein du microenvironnement tumoral, augmentait l'expression de PD-1 mais également Tim3, CTLA4 et LAG3 à la surface des lymphocytes T CD8+ infiltrant la tumeur, participant ainsi de façon directe à l'épuisement de ces lymphocytes intratumoraux. Au contraire, un traitement par anti-angiogénique ciblant la voie VEGF-A/VEGFR limitait l'expression de ces molécules de co-stimulation inhibitrices à la surface de ces mêmes lymphocytes et par conséquent restaurait une immunité antitumorale. Nous avons ensuite confirmé ces résultats chez l'homme, en montrant qu'une stimulation in vitro des lymphocytes T CD8+ humains permettait une augmentation de l'expression des molécules de co-stimulation inhibitrices(PD-1 et Tim3), dépendante de l'expression de VEGFR2 et de la concentration de VEGF-A dans le milieu de culture. In vivo, nous avons également observé une corrélation entre le phénotype épuisé(PD-1+/Tim3+) des lymphocytes T CD8+ intratumoraux et la concentration intratumorale de VEGF, dans des adénocarcinomes gastriques opérés, après analyse en immunofluorescence. Parallèlement à l'effet direct du VEGF-A sur l'épuisement et la perte de fonction des lymphocytes T CD8+ intratumoraux, nous avons également montré que le VEGF-A agissait sur les Treg intratumoraux. Ainsi, dans un modèle murin de cancer colorectal, un traitement par anti-angiogénique ciblant la voie VEGF-A/VEGFR réduisait la proportion de Tregs intratumoraux de façon significative. De plus, l'inhibition de la voie VEGF-A/VEGFR modifiait aussi le phénotype de ces Tregs, avec une diminution de l'expression de PD-1 et de Tim3 à leurs surfaces. Cette modification de phénotype n'était observée que sur les Tregs exprimant des récepteurs de type 2 au VEGF. L'ensemble de ces résultats semble donc confirmer l'effet immunomodulateur du VEGF-A en démontrant pour la première fois son impact direct sur l'épuisement des lymphocytes T CD8+ infiltrant la tumeur, mais également sur le recrutement et les propriétés immunosuppressive des Tregs intratumoraux.Tumor development is dependent on the successive acquisition of cellular abnormalities conferring growth advantage and allowing clonal expansion. Among these abnormalities, the ability to avoid the surveillance of the immune system has been shown to be essential and constitute a "hallmark" for cancer. To achieve this, tumor develop numerous mechanisms, including the development of an immunosuppressive microenvironment that promotes accumulation of immunoregulatory cells, such as regulatory T cells (Treg), as well as inhibition of intratumoral effector CD8+ T cells. This loss of function, named exhaustion, is characterized by expression of immune inhibitory receptors, such as PD-1, CTLA-4, Tim3 and a progressive loss of function. Within this tumor microenvironment, vascular endothelial growth factor (VEGF)-A has long been studied for its proangiogenic properties, leading to the development of anti-angiogenic therapy, but VEGF-A exhibits also immunomodulatory properties that promote escape to the surveillance of immune system., including accumulation of myeloid-derived suppressor cells (MDSC) and Treg. However, direct role of VEGF-A on intratumoral CD8+ T cells and intratumoral Treg was never assessed. The aim of this study was to assess the impact of VEGF-A/VEGFR blockade on CD8+ T cells but also on intratumoral Treg, first in murine preclinical models and then in humans. First, we demonstrated in a mouse model of colorectal cancer (CT26 tumor) that VEGF-A, produced by tumor cells, increases PD-1 expression on CD8+ T cells but also increases expression of other inhibitory receptors, such as Tim3, CTLA-4 and LAG3. Thus, tumor-derived VEGF-A directly promotes CD8+ T cells exhaustion in tumor. On the contrary, VEGFR-A/VEGFR blockade with anti-VEGF-A antibody or tyrosine kinase inhibitor targeting VEGFR results in a significant reduction of PD-1, Tim3, CTLA-4 and LAG3 expression on intratumoral CD8+ T cells, restoring antitumor immunity. These results were then confirmed in humans. Thus, after in vitro stimulation of human CD8+ T cells, we demonstrated that inhibitory receptors (PD-1 and Tim3) expression was correlated with VEGFR2 expression on CD8+ T cells and with VEGF-A concentration in culture milieu. In gastric adenocarcinoma, we also observed a significant correlation between exhausted phenotype (PD-1+/Tim3+) on intratumoral CD8+ T cells and intratumoral VEGF-A expression, using immunofluorescence staining. In addition to the direct impact of VEGF-A on exhaustion and loss of function of intratumoral CD8+ T cells, we also showed that VEGF-A acts on intratumoral regulatory T cells. Thus, in a mouse model of colorectal cancer (CT26 tumor), VEGF-A/VEGFR blockade with anti-VEGF-A antibody reduces significantly the proportion of Treg cells among CD4+ T cells infiltrating the tumor. Moreover, VEGF-A/VEGFR blockade also altered the phenotype of intratumoral Treg, with a decrease in PD-1 and Tim3 expression, resulting in modifications of their properties. These modifications observed on their phenotype was only observed on Treg expressing type 2 VEGF-receptor (VEGFR2). Therefore these results confirm the immunomodulatory effects of VEGF-A/VEGFR pathway and demonstrate for the first time its direct impact on intratumoral CD8+ T cells exhaustion, but also its effect on recruitment and immunosuppressive properties of intratumoral Treg