Structural characterization of a bacterial megaenzyme involved in the biosynthesis of the colibactin carcinogen

Abstract

Certaines souches d’Escherichia coli résidant dans notre microbiote intestinal produisent la colibactine, un carcinogène dont le rôle a été démontré dans le cancer colorectal et soupçonné dans d’autres cancers. La biosynthèse de la colibactine, comme celle de nombreux métabolites secondaires microbiens d’intérêt médical, repose sur des méga-enzymes appartenant à la famille des synthétases de peptides non ribosomaux (NRPS) et des synthases de polycétides (PKS). Les NRPS/PKS sont constituées de domaines enzymatiques variés, regroupés en modules. Un module NRPS incorpore un acide aminé dans le métabolite en construction alors qu’un module PKS ajoute une chaîne acyle. En plus des domaines enzymatiques, chaque module intègre un domaine non enzymatique nommé « carrier protein », qui présente les substrats et le métabolite en construction aux autres domaines. Chez les NRPS/PKS de type I, plusieurs modules sont fusionnés au sein d’un même polypeptide. La taille et la flexibilité de ces protéines les rend très difficiles à caractériser, même si des avancées majeures ont eu lieu récemment, à la fois pour les NRPS et les PKS. En revanche, aucune protéine hybride NRPS/PKS fusionnée, composée d’un module NRPS associé à un module PKS, n’a été caractérisée structuralement.Le but de cette thèse était la caractérisation structurale de l’hybride PKS-NRPS ClbK, responsable de l’incorporation dans la colibactine d’une unité aminomalonyle et d’un cycle thiazole potentiellement génotoxique. Ce travail a montré que ClbK forme un assemblage dimérique de 480 kDa. La protéine ClbK purifiée est capable d’activer la cystéine, le précurseur du cycle thiazole. La diffusion des rayons X aux petits angles a révélé que ClbK possède une forme allongée, de dimension maximale 30 nm et les modèles ab initio générés suggèrent la présence de plusieurs chambres catalytiques, déjà identifiées chez les PKS.Parallèlement, la structure du module PKS de ClbK (85 kDa) a été résolue à 3 Å par cristallographie aux rayons X. Ce fragment forme un assemblage dimérique et possède plusieurs adaptations facilitant ses interactions avec les domaines NRPS en amont et en aval. Le domaine « carrier protein » est détecté à une position inhabituelle, observée une seule fois chez les PKS. La caractérisation de l’état oligomérique en solution de plusieurs fragments multi-domaines de ClbK suggère que ClbK dimérise grâce à deux domaines enzymatiques situés à ses extrémités N- et C-terminales. L’ensemble des données collectées au cours de cette thèse et les données structurales disponibles nous ont permis de proposer le premier modèle architectural d’une protéine hybride NRPS/PKS.Some Escherichia coli strains from the human gut microbiota synthesize colibactin, a causative agent of colorectal cancer and a potential agent involved in other cancers. As is the case for many valuable secondary metabolites produced by micro-organisms, colibactin is synthesized by non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs) and polyketide synthases (PKSs). NRPSs/PKSs use diverse enzymatic domains that are organized into modules. A NRPS module incorporates an amino acid during metabolite assembly, while a PKS module adds an acyl chain. In addition to enzymatic domains, each module integrates a non-enzymatic domain, named carrier protein, that delivers the substrates and the growing metabolite to the enzymatic domains. In type I NRPSs/PKSs, several modules are commonly fused into a single polypeptide. Even if the structural characterization of these megaenzymes is very challenging due to their size and flexibility, major breakthroughs occurred recently both in the NRPS and the PKS fields. However, no fused hybrid NRPS/PKS, composed of a NRPS module associated to a PKS module, has been structurally characterized to date.The main goal of this thesis was the structural characterization of the hybrid PKS-NRPS ClbK, that adds into colibactin an aminomalonyl unit and a thiazole ring that could impart the genotoxic attributes of colibactin. This work demonstrated that ClbK is a 480 kDa dimer. The purified protein catalyzes the activation of cysteine, the precursor of the thiazole ring. Small angle X-ray scattering (SAXS) revealed that ClbK has an elongated shape with a maximal dimension of 30 nm. Ab initio models generated from SAXS data suggest that ClbK possesses catalytic chambers, a common feature of PKS proteins.In parallel, the structure of the PKS module of ClbK (85 kDa) was solved at 3 Å by X-ray crystallography. The structure revealed that the protein is dimeric and harbors several adaptations allowing its interactions with NRPS domains. The carrier protein domain is tethered at an unusual position, observed only once in PKS proteins. Characterization of the oligomeric state of several muti-domain fragments of ClbK suggest that the megaenzyme dimerizes owing to two domains located at its N-terminal and C-terminal extremities. Data obtained during this work associated with other structural data allowed us to propose the first architectural model of a hybrid NRPS/PKS protein