Molecular biomarkers in HPV-associated (pre-)cancers

Abstract

Les Papillomavirus Humains (HPV) sont des petits virus infectant les épithéliums cutanés et/ou muqueux. Si dans la majorité des cas les infections par HPV sont asymptomatiques, certaines d’entre elles sont associées à l’apparition de condylomes ou de lésions précancéreuses et de cancers au niveau du col de l’utérus, du pénis, de la vulve, du vagin, du canal anal et des voies aérodigestives supérieures. L’oncogénicité des HPV est principalement due aux oncoprotéines virales E6 et E7 qui interagissent avec plus d’une centaine de partenaires protéiques cellulaires. Ainsi, de nombreuses voies de signalisation et la machinerie cellulaire sont dérégulés. Le type HPV16 est retrouvé dans la majorité des cancers associés à HPV, suivi de 12 autres, dit à Haut Risque (HR). Chaque type HPV est composé de plusieurs lignées et sous-lignées ayant des impacts différents sur le risque pour le patient de développer des lésions (au moins dans le cas d’HPV16). Il est donc nécessaire d’établir un protocole simple et efficace permettant le séquençage des génomes complets de ces HPV-HR pour pouvoir mieux comprendre les mécanismes d’oncogenèse associés à chaque type. Cela permet aussi d’étudier des variants spécifiques à chaque type et d’établir des liens avec les données cliniques. Les objectifs de cette thèse ont été de développer et de mettre au point une méthode de séquençage des 13 HPV-HR de façon simple, sans avoir à générer de sondes ou d’amorces spécifiques à chacun des types. En parallèle, un NGS de génome complet a été réalisé sur les HPV16 présents dans des frottis de col de l’utérus de patientes éliminant leur infection ou développant des lésions de haut grade. A l’aide de comparaisons statistiques, de prédictions in silico d’immunogénicité et de structures protéiques ainsi que d’analyses in vitro, nous avons tenté d’établir un lien entre la découverte de certaines mutations et leur impact phénotypique. Le protocole de séquençage a été réalisé à l’aide des sondes présentes dans la trousse de détection HPV Hybrid Capture 2 (HC2). Les résultats ont été validés en comparant le type détecté par NGS avec celui détecté en LiPA, un test de génotypage, et avec celui détecté en qPCR spécifique. Les mêmes types ont été retrouvés dans la majorité des cas, démontrant la preuve de principe de cette méthode. Dans le cas de l’étude des variants d’HPV16, quelques mutations ont été retrouvées significativement différentes entre les HPV qui ont été éliminés et ceux ayant favorisé l’apparition de lésion, mais c’est la mutation H78Y d’E6, se trouvant au sein du site d’interaction avec IRF3, que nous avons étudiée. L’expression en RT-qPCR d’E6 était semblable entre la version mutée et la version de référence du gène. Ce n’était pas le cas avec l’expression d’IFN-β, produit grâce à une stimulation par IRF3, qui était plus élevée avec la version mutée d’E6 mais sans atteindre la significativité. Etudier l’impact et le rôle des différentes mutations retrouvées au sein de variants spécifiques des 13 HPV-HR induisant des cancers est essentiel afin de prédire plus efficacement l’évolution d’une infection et a fortiori d’assurer une prise en charge médicale optimale.Human Papillomaviruses (HPV) are small virus infecting cutaneous and squamous epithelia. Most of the time, HPV infection is asymptomatic, but some HPV types are associated with warts or precancerous and cancerous lesions at the uterine cervix, penis, vulva, vagina, anal canal and head and neck. HPV oncogenicity is essentially due to viral oncoproteins E6 and E7 which interact with more than 100 protein partners from the host cell. Plenty of signalization pathways and cellular machinery are impacted by those interactions. HPV16 type is found in the majority of HPV-associated cancers, followed by 12 other High-Risk (HR) HPV. Each type is subdivided in lineages and sub-lineages, having different impact on cancer development risks (at least for HPV16 sub-lineages). It is therefore essential to establish an easy and reliable method to sequence HR-HPV whole genomes in order to understand oncogenesis mechanisms associated with each type. It will also allow the study of type specific variants and the establishment of links between those variants and cancers. This PhD thesis had 2 purposes: on the one hand, the development of a sequencing protocol to easily realize whole-genome sequencing of 13 HR-HPV, without any probe design. On the other hand, HPV16 whole-genome analysis was realized by NGS between groups of patients clearing their cervical infection or developing high-grade lesions. Thanks to statistical comparison, in silico immunogenicity prediction and protein structure predictions as well as in vitro analysis, we aimed to establish a link between certain mutations and a phenotypical impact. Concerning the development of the sequencing method, it was realized with probes included in the Hybrid Capture 2 (HC2) HPV screening test. Results were validated by comparing type detected by NGS, LiPA (genotyping technic) and specific qPCR. The same types were retrieved in most of the cases, showing the proof-of-principle of this new technic of library capture. In the case of the HPV16 whole-genome analysis, some mutations were significatively different between the 2 groups, but we choose to study the H78Y mutation within the E6 gene because of its position in the interaction site with IRF3. E6 expression by RT-qPCR was assessed for mutated and reference E6 that showed the same expression level. It was not the case for IFN-β expression, normally expressed under IRF3 activation, which was higher with the mutated version of E6 compared to the reference, without reaching significance, though. Studying the impact and the role of mutations found within specific variants of 13 HPV-HR associated with cancers is essential to predict efficiently the evolution of the infection and, by using this finer patient classification, for an optimal medical care