Nanobodies ciblant spécifiquement et modulant le récepteur nicotinique acétylcholine alpha 7 humain

Abstract

Les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine alpha7 (nAChR alpha7) sont des pentamères homomériques exprimés abondamment dans le système nerveux central, en particulier dans l'hippocampe et le cortex frontal qui sont impliqués dans la mémoire et la cognition. Les dysfonctions de ces récepteurs sont impliquées dans de multiples maladies neurologiques et psychiatriques, en particulier l'addiction, la douleur, la maladie de Parkinson, ADHD et la maladie d'Alzheimer. Il a été bien établi que l'augmentation de l'activité de ces récepteurs par des modulateurs allostériques positifs (MAPs) était une stratégie prometteuse pour améliorer les déficits cognitifs. Dans ce travail, nous avons construit un procédé pour isoler efficacement des nanobodies ciblant les nAChRs, qui a permis d'isoler plusieurs nanobodies ciblant alpha7. L'un d'eux, nommés E3, a toutes les caractéristiques d'un MAP de type 1, produisant une potentialisation des effets de l'ACh à de concentrations dans la gamme des nanomolaires, augmentant fortement l'efficacité de l'ACh et faiblement sa puissance. Une construction bivalente où deux nanobodies sont fusionnés (E3-E3) montre une potentiation prolongée, même après un rinçage des cellules pendant une heure, indiquant une augmentation importante d'affinité. Un autre nanobodie (C4) de la librairie n'a pas d'effet sur l'activation par l'ACh, mais bloque l'effet de E3. Ces deux nanobodies sont spécifiques pour alpha? et ne reconnaissent pas l'autre nAChR majeur du cerveau, le nAChR alpha4beta2. L'ensemble des données sont prometteuses pour le développement de MAPs servant d'outils pharmacologiques avec un potentiel lointain en clinique.The α7 nicotinic acetylcholine receptors (α7 nAChR) are homomeric pentamers widely expressed in the central nervous system (CNS), especially in hippocampus and frontal cortex that are tightly connected to cognition and memory. The dysfunctions of α7 nAChRs are involved in multiple neurological and psychiatrie disorders, including addiction, pain, Parkinson's disease (PD), attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) and Alzheimer's disease (AD). lt has been well-documented that enhancement of α7 nAChRs activity bypositive allosteric modulators CPAMs) is an attractive therapeutic strategy to ameliorate cognitive defects. In the present study, we have constructed an innovative pipeline to efficiently isolate nanobodies targeting pentameric ligand-gated ion channels(pLGICs), by which we managed to isolated α7 nAChR specifically targeted nanobodies. One of them (E3) exhibits prototypical features of type 1 PAM by showing a 5 times potentiation effect on ACh evoked current in nanomolar concentration range (n>SO), which has much more effect on potentiating ACh's efficacy to α7 nAChRs than apparent affinity. The bivalent construct (EE) based on this VHH shows long-standing potentiation affects that can retain the similar potentiation even after 1 hour of washing, demonstrating its superior affinity property against α7 nAChRs. Another VHH from the library has no modulation effect on ACh evoked current. lnstead, it could block the potentiation effect of E3 VHH by both coapplication manner or biparatopic construct (CE). Both of VHHs showed α7 nAChRs selectivity by direct staining with fluorophore-labeled VHH