Genetic alterations contribute to the development and pathogenesis of several human cancers. These mutations accumulate in a cancer tissue over the course of time due to the instability of the cancer genome. Large-scale sequencing efforts have enabled identification of an abundance of these somatic mutations, and the amount of data is constantly increasing due to the improved accessibility of next-generation sequencing technologies. From this multitude of cancer-associated somatic mutations, a large majority are predicted to be inconsequential “passenger” mutations, (i.e., mutations which do not confer a selective growth advantage to the cancer cells); and only a handful have been validated as “driver” mutations (i.e., mutations playing a critical role in the development or maintenance of cancer). These driver mutations also function as predictive markers for survival, therapeutic efficacy, and often make the cancer cells susceptible to therapeutic intervention.
Identification of driver mutations is an integral part of biomarker discovery in cancer research, and my thesis aimed to address this by developing a screening platform and a database. The in vitro Screen for Activating Mutations (iSCREAM) is a high-throughput screening workflow which was established with Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) as a model. The screen was validated by detection of known activating mutations like EGFR L858R. A previously known EGFR variant of unknown significance (VUS), EGFR A702V, was discovered in the screen and was functionally characterized to be an activating mutation. The iSCREAM screening methodology was further used to systematically study ERBB4, another gene in the EGFR family of receptor tyrosine kinases. We detected ERBB4 VUS R687K, and E715K in the screen and identify them as activating mutations. The ERBB4 mutations were characterized for their effect on ERBB4 phosphorylation, their sensitivity to various tyrosine kinase inhibitors, and their tumorigenicity was evaluated with in vivo allografts.
The Database Of Recurrent Mutations (DORM), was prepared by analyzing a public registry of somatic mutations and preparing a catalog of the mutations identified from genome-wide studies to recapitulate the “real-world” frequency of all the recurrent (n > 1) somatic mutations. DORM allows limiting the scope of search to 38 tissue types and supports advanced queries using regular expressions. The easy-to-use database and its backend are written to be very responsive and fast in comparison to contemporary public cancer databases.
Taken together, the findings and resources presented in this thesis establish grounds for further studies with other tyrosine kinases and potentially enable diversification into new niches.Uusia työkaluja syöpää aiheuttavien mutaatioiden tunnistamiseksi
Geneettiset muutokset vaikuttavat useiden ihmisen syöpien syntyyn ja kehittymiseen. Syöpäkudokseen geenimutaatioita kertyy yhä enemmän ajan kuluessa syövän genomisen instabiliteetin vuoksi. Laajamittaisten sekvensointihankkeiden avulla on pystytty tunnistamaan paljon erilaisia somaattisia eli hankinnallisia mutaatioita ja sekvensointitulosten määrä kasvaa jatkuvasti uuden sukupolven sekvensointitekniikoiden (engl. next generation sequencing, NGS) paremman saatavuuden ansiosta. Näistä lukuisista syöpään liittyvistä somaattisista mutaatioista suurin osa on potilaan ennusteen kannalta merkityksettömiä "matkustajamutaatioita" (engl. passenger mutation) eli mutaatioita, jotka eivät anna valikoivaa kasvuetua syöpäsoluille. Vain muutamia somaattisia mutaatioita on validoitu "ajajamutaatioiksi" (engl. driver mutation) eli mutaatioiksi, joilla on kriittinen rooli syövän kehittymisessä tai ylläpitämisessä. Nämä ajajamutaatiot toimivat usein eloonjäämisen sekä hoidon tehon ennusteellisina markkereina ja usein myös herkistävät syöpäsoluja hoidoille.
Ajajamutaatioiden tunnistaminen on olennainen osa syövän biomarkkereiden tutkimusta. Väitöskirjatyöni tavoitteena oli kehittää ajajamutaatioiden seulonta-alusta ja tietokanta. Aktivoivien mutaatioiden in vitro -seulonta (engl. in vitro Screen for Activating Mutations, iSCREAM) on tehoseulontamenetelmä, jonka kehittämistyössä käytettiin mallina epidermaalista kasvutekijäreseptoria (EGFR) koodaavaa geeniä iSCREAM-seulonnalla tunnistettiin jo tunnettuja aktivoivia EGFR-mutaatioita, kuten L858R, mikä validoi menetelmän toimivuuden. Seulontamenetelmällä tunnistettiin ja karakterisoitiin myös uusi EGFR-geenin aktivoiva mutaatio, A702V, jonka oletettu toimintamekanismi selvitettiin. iSCREAM-seulontamenetelmää hyödynnettiin tässä työssä myös EGFR-reseptorityrosiinikinaasiperheen toisen geenin, ERBB4-geenin, systemaattiseen tutkimiseen, jonka avulla löydettiin uusina aktivoivina mutaatioina ERBB4 R687K ja E715K. Näiden ERBB4-mutaatioiden vaikutusta ERBB4:n fosforylaatioon ja lääkeherkkyyteen erilaisille tyrosiinikinaasiestäjille karakterisoitiin, ja niiden tuumorigeenisyys validoitiin in vivo -allografteissa.
Toistuvien mutaatioiden tietokanta (engl. Database Of Recurrent Mutations, DORM) luotiin analysoimalla somaattisten mutaatioiden julkista rekisteriä ja laatimalla luettelo genominlaajuisissa tutkimuksissa tunnistetuista mutaatioista, jotta kaikkien toistuvien (n > 1) somaattisten mutaatioiden "todellinen" esiintymistiheys voitaisiin laskea. DORM mahdollistaa haun rajoittamisen 38:aan kudostyyppiin ja tukee edistyneempiä kyselyjä säännöllisten lausekkeiden (engl. regular expression) avulla. Helppokäyttöinen tietokanta ja sen taustajärjestelmä kehitettiin hyvin reagoivaksi ja nopeaksi nykyisiin julkisiin syöpätietokantoihin verrattuna. Tässä työssä esitetyt havainnot ja resurssit luovat yhdessä perustan jatkotutkimuksille muilla tyrosiinikinaaseilla ja ovat mahdollisesti laajennettavissa muillekin tutkimusalueille
