Steege, Gerrit van der

Dutch

ARTS repository - University of Groningen

   University of GroningenDirect gene transfer to plant protoplasts, basic aspects and applicationSteege, Gerrit van derIMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of recordPublication date:1991Link to publication in University of Groningen/UMCG research databaseCitation for published version (APA):Steege, G. V. D. (1991). Direct gene transfer to plant protoplasts, basic aspects and application. s.n.CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).The publication may also be distributed here under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license.More information can be found on the University of Groningen website: https://www.rug.nl/library/open-access/self-archiving-pure/taverne-amendment.Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.Download date: 21-06-2022CHAPTER VIIISAMENVATTINGDirecte gen overdíacht, direct genetransÍer (DGT), naar gersoleerde plantecel len(protoplasten), zonder biologische vectoÍ (e.9.bacterie oÍ virus) als intermediaií ,  wordt in hetplanten-onderzoek hooÍdzakel i jk gebruiktvooÍ twee doeleinden: de oroductie vanstabiel getransÍormeerde planten oÍ weeíselsen het meten van transiënte expressie van,veelal chimaera, genen. Men spreekt vanstabiele transÍormatie, wanneeí het exogeneDNA geïntegreerd raakt in het gastheergenoom en stabiel aanwezig blijÍt. ExogeenDNA kan na opname in de protoplasten extÍa-chromosomaal tot expÍessie komen; dezeexpressie heeft een tijdelijk karakteÍ en wordtdaarom transiënte xpressie genoemd.In beide geval len worden DNA moleculen,meestal bacteriële plasmiden met daaÍop degewenste genen, ingebracht in zoveelmogeli jk protoplasten. Opname kanbewerkstel l igd worden door de protoplast-membranen doorlaatbaaÍ te maken metchemical ién (bi jvoorbeeld poly-ethyleenglycol, PEG) of met elektÍ ische velden(e lec t ropora t ie ) .  In tegra t ie  van he topgenomen gen in het protoplast genoomvindt niet in iedere behandelde cel olaats enbovendien niet alt i jd op een dusdanige plaatsin het genoom, waar het in voldoende matetot expressie komt. Deze lage Írequentie vanstabiele transÍormatie maakt het gebruik vanselecteeÍbare genen praktisch noodzakeli jkbi i  di t  soort experimenten. Produktie vanstabiele transíoímanten kan, als praktischetoepassing, leiden tot de ontwikkel ing vanplanten met nieuwe eigenschappen, diebi jvoorbeeld een verhoogde produktie oÍziekte-resistentie tot gevolg hebben.Anderzi jds kunnen stabiele transfoÍmantengebruikt worden voor moleculair biologischeexperimenten, bi jvoorbeeld voor debestudering van de Íunctie en Íegulat ie vangenen. Echter, het expÍessie nivo van hetingebrachte gen is aÍhankeli jk van de plaatsop het genoom, waaÍ het geintegreerd is. Ditbemoeil i jkt het trekken van conclusies uitexperimenten waarbi j  expressie nivo's vanverschi l lende gen-constÍucten veígelekenworden. Grote groepen individuele stabieletransÍormanten dienen gegeneÍeerd en ge-analyseerd te worden om conclusies te/ Á ^ h f i r . . r . l i ^ ê nVoor het meten van transiénte xpressie isde detecteerbaarheid van het gen-produktvan het ingebrachte gen van belang. Hetgrote voordeel van het meten van tÍansiénteexpressie ten opzichte van het maken vanstabiele transÍoímanten voor gen-expressiestudies is het enorme verschi l  in t i jd-st ip,waarop de resultaten van de experimentengeanalyseerd kunnen worden. Terwij l  hetselecteren en regenereren van een stabieletransÍormant, zelÍs vooÍ de "snel leÍe"plantensoorten en tíansÍormatie methoden, algauw een paar weken duurt en met eenprotoplast als uitgangspunt zelfs maanden,kan het resultaat van transiënte exoressiereeds 1 à 2 dagen na DNA-opname gemetenworden. Bovendien wordt bi j  het meten vantíansiënte expressie het gemiddeldeexpressie nivo bepaald in een groot aantalcel len, waaÍdoor vergel i jkingen gemaaktkunnen worden tussen verschi l lende oen-constructen.Dit proeíschrif t  beschri j f t  onderzoek,waarin de DNA overdracht naar pÍotoplasten,hoofdzakel i ik via electÍoporatie, bestudeerdwerd. Ruwweg kan het beschreven onderzoekin twee gedeelten woÍden gespl i tst.  Het eerstegedeelte (Hoofdstukken l l ,  l l l  en lV) beslaatonderzoek naar het t ÍansÍormatie proces opzich en de reactie van pÍotoplasten op deopname van DNA. In het tweede gedeelte(Hoofdstukken Vl en Vl l)  wordt detoepasbaarheid van het meten van transiënteexpressie onderzocht en geillustreerd aan dehand van analyse van expressie van het B-glucuronidase (GUS) Íeportergen ondertranscript ionele controle van (gedeelten van)de promotoÍ van het korrelgebonden zetmeel-synthase gen uit  aardappel.90 CHAPTER VIIIln Hoofdstuk I wordt eeÍst een korteinleiding gegeven oveÍ transÍoÍmatie vanprotoplasten om vervolgens uitgebreider in tegaan op een aantal stappen in hettíansÍormatie proces: a) de DNA overdrachtnaar píotoplasten, d.w.z. de passage van depÍotoplast membraan; b) de detectie van detransfoímatie, d.w.z. de diverse merker- enÍeporter-gen systemen, die recentelijkontwikkeld zi jn; en c) de expressie van hetopgenomen DNA: aandacht woÍdt besteedaan Íactoren, die het transiënte expressie nivokunnen beïnvloeden.De methode van DGT, zoals die t i jdens deondeÍzoek-oeÍiode ontwikkeld is voor o.aaardappel suspensie protoplasten met behulpvan electroporatie en het GUS reporteÍgen,staat beschíeven in HooÍdstuk ll.Een last ig punt bi j  het vergel i jken vanelectroporatie experimenten, beschíeven inde literatuur, is het íeit dat de resultatenverkregen zijn met verschillende appaÍatuuíen met verschi l lende vormen van elektr ischevelden. Het gebruik van zowel (meervoudige)korte blok-pulsen, zoals toegepast bi j  hetelectroÍusie proces, als wel van langere,exponentieel aïnemende pulsen (ontladingvan een condensator) kan leiden tot meetbaÍetíansiénte exoressie. ln HooÍdstuk l l l  is deinvloed van elektr ische velden op deprotoplast membraan nader bestudeerd metbehulp van zowel DNA-electroporatie alselectroíusie expeíimenten. Bi j  Íusie van deprotoplasten, veÍoorzaakÍ dooí een korte blok-puls met een hoge spanning (toegediend naopli jnen van de protoplasten in eenwisselspanningsveld), bleek een kri t ischepuls-spanning nodig te zi jn om Íusie teveroorzaken. Bij hogere voltages werdenrespectabele (>50%) fusie peícentagesgevonden. DNA opname na toediening vandezê "Íusie"-pulsen was echter niet erge f Íec t ie f  .  De langere ,  exponent iee laÍnemende, eleklr ische velden, alsmedecomplexe pulsen, bestaande uit  een hoge eneen, langere, lage spanning-component,bleken etfectiever. Het fusie-gedrag vanpíotoplasten bleek wel een voorspel lendewaarde te kunnen hebben voor de elektr ischeparameters, nodig vooí effectieve DNA-opname.De mate van transiênte expressie en deÍreouentie van stabiele transÍormantie is totop zekere hoogte afhankelijk van dehoeveelheid opgenomen DNA. Echter,wanneer het DNA eenmaal is opgenomen inde píotoplasten, betekent dit  niet,  datautomatisch hóge tíansiënte expressie nivo'sbereikt,  oí gÍóte aantal len stabieletÍansÍoímanten geproduceerd kunnenworden. Protoolasten van verschi l lendeplanten, ook al behoÍen ze tot dezelfde soort,kunnen verschi l len in hun "competentie" omop exogeen DNA te reageÍen. Hoofdstuk lVbehandelt expeÍimenten, waarin getÍachtweíd de (verschi l lende) Íeactie vanpÍotoplasten op de opname van DNA teonderzoeken. Een eerste gedachte, dat demate van nuclease aanwezigheid (een DNAafbÍekende werking, tevens ooízaak van hettijdelijke karakter van transiënte expressie) inde píotoplasten, het nivo van expressiebepaalt,  bleek niet op te gaan. Aanwijzingenwerden gevonden, dat verschi l len in dehoeveelheid aanwezige nuclease activi teittussen de diverse soorten protoplastenposit ieÍ noch negatieÍ correleerden met hetnivo van tÍansiënte expíessie. Tevens bleek,dat met het gebÍuikte electÍoporatie systeemde omstandigheden waaronder maximaletransiënte expressie werd bereikt, gÍotegevolgen had vooÍ het overlevings-peÍcentage van de protoplasten. Vaak gingeen overleving van 2O7" oÍ lager gepaard metde hoogste expressie in het betreffendeexperiment. Dit hoge sterfte cijfer van deprotoplasten bleek niet zozeer het gevolg tezi jn van de elektr ische behandeling, als welvan de opname van DNA of de combinatievan beide. Ondanks lage overleving van dêprotoplasten en een snelle aÍbraak van hetopgenomen DNA kunnen bl i jkbaar zeer goedtransiënte expressie experimenten gedaanworden. Uit een aantal expeÍimenten bleek,dat veel andere modiÍ icat ies ootreden aan hetaangeboden DNA. Ligatie van l ineaire stukkenDNA bleek een proces, dat veelvuldigCHAPTER VIIInodig vooÍ effectieve DNA-van transiënte expressie en deln stabiele tÍansformantie is tothoogte aÍhankelijk van deopgenomen DNA. Echter,DNA eenmaal is opgenomen insten, betekent dit  niet,  dathóge transiénte expressie nivo'sgÍóte aantallen stabiele9n geproduceerd kunnenotoplasten van verschillendeal behoren ze lot dezelfde soon,rhi l len in hun "competentie'  omDNA te reageren. HooÍdstuk lVxpenmenten, waaÍin getracht(verschillende) reactie vanop de opname van DNA teEen eeÍste gedachte, dat deolease aanwezigheid (een DNAeÍking, tevens oorzaak van hetder van líansiënte expressie) inten, het nivo van expÍessteí niet op te gaan. Aanwijzingennden, dat verschi l len in oeaanwezige nuclease activiteitCiverse soorten protoplastennegatief correleerden met nel;iënte expressie. Tevens bleek,ebruikte electroporatie systeem;heden waaronder maximalepressie werd bereikt, gÍotetd voor het overlevings-n de protoplasten. Vaak gingvan 20% oÍ lager gepaard met:xpressie in het betreffenoeit hoge slerfte cijíer van deleek niet zozeer het gevolg te:ktr ische behandeling, als werre van DNA oÍ de combinarredanks lage oveÍleving van den een snel le aÍbraak van het,lA kunnen blijkbaar zeer goedressie experimenten gedaann aantal experimenten bleek,modiíicaties optreden aan het,lA. Ligatie van lineaire stukkenen proces, dat veelvuldiovoorkwam. Opvallend was o.a., datelectropoÍatie van twee gelineaÍiseeÍdeplasmiden, met op het ene molecule hetrêpoÍteÍgen en op hei andere de benodigdepíomotor, resulteeÍde in transiënte expressietot 20-30% van het nivo bereikt met een intactchimeer construct. Het transÍormatie systeemen het gebruik van protoplasten woíden kortgeëvalueerd in Hooídstuk V.Hoofdstukken Vl en Vl l  gaan in op hetgebruik van transiënte expressie metingenom het íunctioneíen en de regulat ie tebestuderen van het korrelgebonden zetmeel-synthase gen uit  aardappel. Dit gen (Granule-Bound Starch Synthase, GBSS) isveÍantwooídelijk voor de produktie vanamylose, een component van zetmeel.Promotor Íragmenten van dit  gen werdengekoppeld aan het GUS reportergen.Hoofdstuk Vl bespreekt karakterisering van destíuctuuÍ van de GBSS oromotoÍ viatíansiénte expressie metingen, uitgevoeÍdmet chimaera constíucten in suspensiepÍotoplasten van 3 aardappel cel l i jnen en eenwortel l i jn. Het GUS gen bleek goed totexpressie te komen onder invloed van GBSSpromotor sequenties. Tevens konden metbehulp van transiénte expressie experimentenduidel i jke verschi l len in act ivi teit  tussen dediverse constructen gemeten worden. O.a.bleek de oromotor act ivi teit  van een 0.4 kbfÍagment groter te zi jn dan die van eenfÍagment van 0.8 kb.HooÍdstuk Vl l  beschri j f t  onderzoek naargereguleerde transiënte expressie van deGBSS-GUS chimaera genen. Transiënteexpressie weÍd gemeten in blad-protoplastenvan diverse soorten olanten. Met name inaardappel protoplasten bleek het expressienivo in blad pÍotoplasten beduidend lagerdan in, ongedifÍerentieerde, suspensiepÍotoplasten. lncubatie van suspensieprotoplasten in licht, na transÍectie met DNA,bleek een remmende werking te hebben optÍansiënte GBSS-GUS expressie; dit  integenstelling tot blad protoplasten, Analysevan stabiele tÍansÍoÍmanten toonde aan, dateen GBSS píomotoÍ íragment van 0.4 kbvoldoende was vooÍ weefsel-aÍhankeli jke GUSexpressie: zowel voor de 0.4 kb als de 0.8 kbGBSS promotor kon, vergeleken metexpressie in blad, tot een 1500-voudigeverhoging van GUS activi teit  gemeten wordenin geïnduceerde microknollen. Transiënteexoressie van de GBSS constructen konverhoogd worden door suspensies gedurendelange t i jd te kweken bi j  hogere sucíoseconcentrat ies.Het gebruik van pÍotoplasten vooí deproduktie van stabiele t ÍansÍormanten zal,vooral met de opkomst van nieuwere DGTtechnieken als de "part icle gun", waarschi jnl i jkmindeÍ belangri jk worden. Echter, met namede experimenten uit  de HooÍdstukken Vl enVll  tonen de waarde van tÍansÍormatie vanprotoplasten en het volgen van transiênteexpressie van ingebrachte gen-constructenvooí moleculair genetisch onderzoek.Wanneer weeÍsel-aÍhankeli jke gen-expressiebestudeeÍd woídt, met behulp van chimaeragenen, dan l igt de noodzaak van hetgenereÍen van stabiele transfoÍmanten vooÍde hand. Verschi l len in expressie niveaus,gemeten in diverse weefsels van eentÍansgene plant, kunnen informatieverschatÍen over de werkino en reoulatie vaneen planten-gen.Echter, wanneer de sterkte van een promotorof de verschillende activiteit van meerderepromotor Íragmenten bepaald moet woíden,dan zi jn t íansiënte expressie expeíimentenzeeí nutt ig. Het feit  dat een gevonden waaídevoor transiênte expressie de gemiddeldeexpressie vertegenwoordigt van een paaÍhonderd duizend individuele cel len, maakt ditsoort experimenten superieur aan de analysevan,  g ro te  hoevee lheden,  s tab ie letransÍormanten.CHAPTER VIII Y I

Direct gene transfer to plant protoplasts, basic aspects and application

https://pure.rug.nl/ws/files/14485921/Steege.PDF

Direct gene transfer to plant protoplasts, basic aspects and application

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

ARTS repository - University of Groningen