Schreuder, Herman Antony

Dutch

ARTS repository - University of Groningen

   University of GroningenX-ray christallographic studies on the enzymatic mechanism of p-HydroxybenzoateHydroxylaseSchreuder, Herman AntonyIMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of recordPublication date:1988Link to publication in University of Groningen/UMCG research databaseCitation for published version (APA):Schreuder, H. A. (1988). X-ray christallographic studies on the enzymatic mechanism of p-Hydroxybenzoate Hydroxylase. s.n.CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).The publication may also be distributed here under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license.More information can be found on the University of Groningen website: https://www.rug.nl/library/open-access/self-archiving-pure/taverne-amendment.Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.Download date: 21-06-2022SamenvattingOnderwerp van dit proefschrift is onderzoek met behulp van eiwitkristallografie en mod-elbouw naar het katalytisch mechanisme van het enzym p-hydroxybenzoate hydroxylaselrit Pseudomonas fl,uorescens. p-Hydroxybenzoate hydroxylase is een bacterieel enzymwat de inbouw van moleculaire zuurstof in een aromatisch substraat (p-hydroxybenzoaat)katalvseert:HOo /^\ //o(, * o, + NADeH + H+ .----* H0<( )>-i l  + Hao + NADe+'o- Y b-H OEén zuurstof atoom wordt ingebouwd in het substraat en het andere zuurstof atoomwordt gereduceerd tot water. Het enzym gebruikt niet covalent gebonden Flavine AdenineDinucleotide (FAD) als een Katalysator en NADPH zorgt voor het benodigde reducerendvermogen. Gesubstitueerde aromatische verbindingen zoals p-hydroxybenzoaat worden ingrote hoeveelheden in de natuur geproduceerd by de biodegradatie van lignine, één van dehoofdbesta^nddelen van hout. Organismen zoals PseuiLomonas bacteriën hebben daaromeen groot aantal enzymen ontwikkeld om deze verbindingen te kunnen verteren.Omdat twee substraten (p-hydroxybenzoaat en zuurstof) en twee cofactoren (FADen NADPH) betrokken zijn bij de reactie va^n p-hydroxybenzoaat hydroxylase, is het re-actiemecha^nisme ingewikkelder dan dat van vele a^ndere enzymen. Hieronder volgt eenschema met de verschillende complexen die optreden tijdens de reactie:3,1 d i 0tlBePHSH,FAOP|lB|-|.FAD,3,1 di OHBIHro-\\PI]BH.FAOHz- 0  P0HBP|1B|l.FAD. p0||B\,.- *00","I(,@NAI)P'PHBH FM IOHB NADPH .PHBt|.FAOH2. pOHB(tPHBH : p-hydroxybenzoaat hydroxylase; pOHB : p-Hydroxybe rrzoaa;t i 3,4- dio HB :3,4-dihydroxybenzoaat, , \@101Na binding van het substrate (1,2) wordt het enzymgebonden FAD gereduceerd doorNADPH (3,4). Hei gereduceerde FAD reageert zeer snel met zuurstof tot een covalentcomplex (5) gevolgd door de vorming van het reactie product en het vrijkomen van water(6,) De kristal structuren van de complexen 2, 4 en 6 zullen worden beschreven. Destructuur van 5 is onderzocht met behulp van rnodelbouw studies.Het enzyme-substraat complex (2) p-Hydroxybenzoaat hydroxylase wordt routine-matig gekristalliseerd als het enzym-substrazrt complexl'2. De structuur is opgehelderd bij2.5 Á resolutie3. Het was mogelijk om de resolutie te verhogerr tot 1.9 À doo. gebruikte maken van intense synchrotron straling. Kristallografische verfijning tegen deze hogeresolutie gegevens leverden een verbeterd model. Een aantal lussen, die aanvankelijk ver-keerd geplaatst waren, zijn nu op de juiste manier in de electronen dichtheid gepast. Deuiteindelijke kristallografische R-factor was 15.6 %.De flavine ring, waarvan men dacht dat hij vlak was, bleek licht gebogen te zijrr. De ringwas ongeveer1O9" gebogen en we1 op dezelfde manier als het flavine peroxide intermediair(5) gebogen is. Dit laatste intermediair zal verderop besproken worden. In het actievecentrum werden twee water moleculen gevonden die in contact met de flavine ring waren.Zes van acht peptide plaatjes in de buurt van de flavine ring wijzen met hun gedeeltelijkpositieve stikstof naar de flavine ring en zu11en dus een positief electrostatisch effect op dering uitoefenen.Het enzym rnet gereduceerd FAD (4) Gele kristallen van het enzym-substraatcomplex met geoxideerd FAD werden anaeroob gedrenkt in een oplossing met 300-400mM NADPH. Een kleurverandering in de kristallen van geel naar kleurloos geeft aan dathct enzyme-gebonden FAD is gereduceerd. Dit rverd bevestigd met behulp spectroscopieaan éénkristallen2. Een verschil Fourier tussen gegevens van geoxideerde en gereduceerdekristallen van het enzyme-substraat complex vertoonde zeer weinig kenmerken. Na kristal-lografische verfijning bleken de verschillen tussen geoxideerd en gereduceerd enzym min-imaal te zijn. Het gereduceerde flavine was vlak en van een vlinder buiging van de ringzoals was gevonden in modelverbindingena is geen sprake. Dit is in overeenstemming metNMR resultaten van Miiller en medewerkerss.Het flavin 4a-hydroperoxide intermediair (5) De zuurstof bevattende flavine in-termediairen hebben een ievensduur in de orde van milliseconden6 en kunnen daarorn nietworden bestudeerd met conventionele róntgen diffractie. Modelbouw studies gaven echterenige interessante resultaten. Het flavine 4a-hydroperoxide intermediair wat ontstaat wan-ner zuurstof reageert met het gereduceerde flavine is aangegeven in Figuur 1 a. De structuurvan 4a,5-epoxyethano-3-methyl-4a,5-dihidrolumiflavin (Figure 1b) werd als een model ge-bruikt. Deze verbinding werd gekozen omdat de kristal structuur bekend wasT en derDrenth,  J. ,  Hol ,  W.G.J.  & Wierenga, R.K.  (1975) J.Bio l .Chem. 25O,52682Van der Laan, J.M. (1986) Proefschrift, Rijks Universiteit Groningen3Wierenga, R.K. ,  De Jong, R.J. ,  Kalk,  K.H.,  Hol ,  W.G.J.  & Drenth,  J.  (1979) J.Mol .Bio l .  LSL,55{Kierkeg;,ard, P., Norrestam, R., Werner, P.-E., Csóregh, I, Von Glehn, M., Karlsson, R., Leyonmark,M.,  Rónnqurst ,  O.,  Stensland,  8. ,  T i l lberg,  O. & Torbjórnson, L.  (1971) ïn Flauins êJ f lauoproteins (Kamin,M.,  ed.)  pp l ,  Univers i ty  park Press,  Bal t imore.sVervoort, J. (1986) Proefschrift, Landbouw Universiteit Wageningen.6Hiromi, K. (1979) Kinelics of Fast Enzyme Reaclions,pp.287, Halsted Press, New YorkTBolognesi, M., Ghisla, L. & Incoccia, L. (1978) Acía Crysíallogr. B 34,8211.02-l-vryt-,|{-+ót lt 0-cHaFIN1 05NH--v\'rzo+#il-?'AH o oCI\6r-l!-'lY:.-;Iu a( b )  '  ' 2 ut o lFiguur 1: (a) flavine 4a-hydroperoxide intermediair (b) model verbinding voor (a). Op:proximale peroxide zuurstof; Od: distale peroxide zuurstof.optische en 13C NMR spectra sterk lijken op de spectra van het flavine 4a-hydroperoxidegebonden aan p-hydroxybenzoaat hydroxylase, respectievelijk bacterieel luciferases's.Vanwege het zuurstof wat reageerde met de C4a koolstof heeft de C4a vier substituentenen wordt tetraëdrisch. Dit veroorzaakt een buiging van de flavine ring. \Manneer dezegebogen flavine in het actieve centrum van p-hydroxybenzoaat hydroxylase wordt gepast,dan blijkt dat de gebogen flavine beter past dan een volledig vlakke flavine ring. Dit laatzien dat het actieve centrum van p-hydroxybenzoaat hydroxylase complementair mei hetfl avine 4a-hydroperoxide intermediair.Het enzyrne-produkt complex (6) Het substraat wat is gebonden in kristallen vanhet enzym-substraat complex, werd omgezet in het product, 3,4-dihydroxybenzoaat doorde katalytische reactie te laten verlopen in de kristallen. Verder werd een hoge concentratievan het produkt toegevoegd aan de drenkvloeistof.De electronen dichtheid die werd verkregen met behulp van deze kristallen liet duidelijkzien welke van de twee mogelijke meta posities werd gehydroxyleerd en legde beperkingenop aan het aantal mogelijke flavine-zuurstof intermediairen.De carbonyl zuurstof van Pro293 maakt een tamelijk korte waterstoÍbrug met de 3-hydroxyl groep van het product. Dit is de hydroxyl groep die geintroducee::d werd doorhet enzym. De carbonyl group heeft bijna zeker ook een wisselwerking met de over tebrengen zuurstof voor en tijdens de hydroxylatie stap. De gedeeltelijk negatieve ladingvan de carbonyl zuurstof zou de polarizatie van de peroxide binding kunnen bevorderenen zo de de reactiviteit van het peroxide, en dus de reactiesnelheid, te verhogen.Enige speculaties over het reactie mechanisme Op basis van de bovengenoemdestucturele resultaten is het mogelijk te speculeren over het reactie mechanisme van p-hydroxybenzoaat hydroxylase. Wanneer we aannemen dat de Oz het actieve centrumbinnenkomt via hetzelfde kanaal als we denken dat de nicotinamide gedeelte van NADPHbinnenkomt, dan is de zuurstof boven de flavine ring op het moment dat het reageert metde C4a koolstof.Modelbouw studies laten zien dat de distale zuurstof, die nu een negatieve lading bezit,een gunstige waterstof brug kan vormen met het eiwit. Na het opnemen van een protonvaÍr een water molecuul in het actieve centrum, kan de distale zuurstof zich verplaatsennaar de hydroxylatie plaats door een draaing om de C4a-Op binding. Na de rotatie wordtde distale zuurstofmin ofmeer op de aan te vallen koolstofvan het substraat gedrukt.EGhisla, S., Entsch,8., Massey, V. & Ilusain, M. (1977) Eur.J.Biochem. 76, f39.eVervoort, J., Miiller, F., Lee, J., Van den berg, W.A.M. & Moonen, C.T.W. (1986) Biochemistry 25,8062. tHet positieve uiteinde van de dipool van de o-helix H10 en enige amide stikstof atomenzijn naar de flavine ring gericht. Op deze manier wordt een positief electrostatisch effect opde flavine ring, en via een water molecuul ook op de proximaie zuurstof, uitgeoefend. Tweegedeeltelijk negatiefgeladen carbonyl zuurstof atomen lijken een omgekeerd electrostatischeffect te veroorzaken bij de hydroxylerings plaats. Voorgesteld wordt dat dit de polarizatievan de peroxide binding zal helpen, wat de de distale peroxide zuurstof zal activeren.Waterstof bruggen naar de 4-hydroxyl group van het substraat en misschien Iadingscompensatie door twee carbonyl zuurstof atomen zorgen mogelijk voor stabilisatie van eenpositief geladen zuurstof-substraat intermediair. Uit de organische chemie is bekendlo datstabilisatie van een dergelijk intermediair ieidt tot activatie van de aromatische ring metbetrekking tot elektrofiele aanval.Hoewel het gepresenteerde mechanisme zeer speculatief is, is het mogelijk dat de ge-noemde factoren voldoende zijn om de reactie binnenin het enzym te laten verlopen, ietswat niet mogelijk is buiten het enzym.roSolomons, T.W.G. (1976) Organic ChemistrE pp. 472, Witey & Sons, New York104

X-ray christallographic studies on the enzymatic mechanism of p-Hydroxybenzoate Hydroxylase

https://pure.rug.nl/ws/files/14473542/noorda0009.PDF

X-ray christallographic studies on the enzymatic mechanism of p-Hydroxybenzoate Hydroxylase

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

ARTS repository - University of Groningen