Shao, Jinfeng

English

Zijketens van aromatische aminozuren zijn vaak betrokken bij kation-π en π-π interacties. Hoewel deze interacties belangrijk zijn voor de stabiliteit en functie van eiwitten, is slechts weinig fundamentele kennis beschikbaar over de sterkte van deze interacties. Een elegante methode om hierin inzicht te krijgen is via het inbouwen van aromatische aminozuren met één tot vier fluoratomen in de zijketen. Echter, de bestaande methoden om deze eiwitten te produceren geven extreem lage opbrengsten. In dit proefschrift wordt een Lactococcus lactis tryptofaan auxotroof expressiesysteem beschreven om deze eiwitten in milligram hoeveelheden en met een hoge inbouwefficiëntie (≥ 95%) te produceren. Gebruik werd gemaakt van een synthetisch groeimedium dat uit slechts 24 componenten bestond, terwijl de meest gebruikte synthetische media voor L. lactis veelal 50 componenten bevatten. Met dit expressiesysteem werd een reeks tryptofaan analogen ingebouwd in het LmrR eiwit. LmrR is een translatie repressor eiwit dat dimeren vormt en aromatische liganden kan binden tussen twee tryptofaan residuen in het dimeergrensvlak. Gevonden werd dat, naarmate meer fluor atomen aanwezig waren in de tryptofaan zijketen, des te lager werd de affiniteit van LmrR voor zijn liganden. Dit is een sterke aanwijzing dat π-π interacties een belangrijke rol spelen om het ligand te binden. Hoge-resolutiestructuren van LmrR met gebonden ligand bevestigen dat de inbouw van fluoratomen in een aromatisch aminozuur geen grote structurele veranderingen induceert. Het hier gepresenteerde L. lactis tryptofaan auxotroof expressiesysteem maakt het nu dus mogelijk om voldoende eiwit te maken om π-π interacties te bestuderen met diverse biofysische methoden.The side chains of aromatic amino acids are often involved in cation-π and π-π interactions. Despite their importance for protein function, our understanding of these interactions is very limited, because they are difficult to study experimentally. One experimental approach is progressive fluorination of the concerned aromatic amino acid, but published protein expression systems yield only very low amounts of labeled protein. Here, we present a Lactococcus lactis Trp auxotroph-based expression system for the efficient incorporation (≥ 95%) of multi-fluorinated Trp analogs. With this system, mg amounts of labeled proteins can be produced. The expression level was improved by developing an optimized chemically defined medium (CDM), which contains only half the number of compounds used in a typical L. lactis CDM medium. Based on this L. lactis Trp auxotroph expression system and the new CDM, the π-π interactions between the protein LmrR and some of its ligands were investigated. LmrR is a dimeric transcriptional repressor from L. lactis that can bind an aromatic drug between two Trp residues at the dimer interface. Progressive fluorination of the Trp residues showed that the affinity for the drug gradually decreased, clearly establishing the importance of π-π interactions for high-affinity drug binding. High-resolution structures of the labeled protein-drug complexes showed for the first time a structural view of the progressive fluorination approach. In conclusion, the developed L. lactis Trp expression system has paved the way to study cation-π and π-π interactions using a variety of biophysical techniques

ARTS repository - University of Groningen

Evaluation of π-π interactions in proteins using Trp analogs:From protein labeling to quantitating the energies involved

https://pure.rug.nl/ws/files/36479781/Chapter_2.pdf

Evaluation of π-π interactions in proteins using Trp analogs:From protein labeling to quantitating the energies involved

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

ARTS repository - University of Groningen