DAS ISCHÄMISCHE ZEITFENSTER VON EKTOPEM ENDOMETRIUM BESTIMMT SEINE FÄHIGKEIT ZUR AUSBILDUNG VON ENDOMETRIOSEHERDEN : Eine experimentelle in vivo Studie im Endometriosemodell der Maus
Die Endometriose ist definiert als das Vorkommen von Endometrioseherden außerhalb des Cavum uteri. Peritoneale Endometrioseherde entstehen hauptsächlich durch retrograde Menstruation. Hierbei wird während der Menstruation abgestoßenes Endometrium durch die Tuben in den Bauchraum transportiert. Dort kann das Gewebe adhärieren, proliferieren und am Peritoneum anwachsen.
Die retrograde Menstruation ist ein physiologischer Prozess, welcher bei bis zu 90 % aller Frauen nachweisbar ist. Es haben jedoch deutlich weniger Frauen eine Endometriose. Somit scheinen noch andere Kofaktoren bei der Entstehung der Krankheit notwendig zu sein. Dabei ist zu bedenken, dass die in vivo Passage von Endometri-umfragmenten aus dem Uterus durch die Tuben in die Peritonealhöhle einige Stunden bis Tage dauern kann. Während dieser Zeit sind die Fragmente avaskulär und hypoxischen Bedingungen ausgesetzt. Unklar ist, wie dieser Zustand die Viabilität, Proliferation, Angiogenese, Entzündungsaktivität und schließlich die Fähigkeit, einen Endometrioseherd auszubilden, beeinflusst.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher zu untersuchen, wie das ischämische Zeitfenster zwischen Entnahme und peritonealem Kontakt von Endometrium die Entstehung, Größenentwicklung, Angiogenese, Apoptose und Immunzellinfiltration von induzierten Endometrioseherden beeinflusst.
Hierzu wurden in einem ersten Studienabschnitt Uterusfragmente von transgenen C57BL/6-TgN(ACTB-EGFP)1Osb/J-Mäusen, deren Gewebe green fluorescent protein (GFP)-positiv ist, isoliert und entweder direkt nach der Entnahme oder nach einer Präkultivierung von 24h oder 72h histologisch und immunhistochemisch untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Zell- und Mikrogefäßdichte 72h-präkultivierter Uterusfragmente im Vergleich zu frisch isolierten und 24h-präkultivierten Fragmenten signifikant erniedrigt und die Apoptoserate signifikant erhöht ist. Zusätzlich wurde ein Proteom-Profiler-Maus-Angiogenese-Array zur Detektion von Angiogenese-relevanten Proteinen durchgeführt. Sowohl in frischen als auch in präkultivierten Uterusfragmenten wurden alle untersuchten Proteine exprimiert. Jedoch zeigten die präkultivierten Uterusfragmente ein deutlich unterschiedliches Expressionsmuster angiogeneserelevanter Proteine gegenüber dem frisch entnommenen Gewebe.
In einem zweiten Studienabschnitt wurden frisch isolierte und präkultivierte Uterusfragmente von C57BL/6-TgN(ACTB-EGFP)1Osb/J-Mäusen an die Bauchwand weiblicher C57BL/6-Mäuse transplantiert. Die Größenentwicklung der so induzierten Endometrioseherde wurde über 28 Tage mittels hochauflösender Ultraschallbildgebung untersucht. Am Ende des Versuchs wurden die Herde entnommen und für weitere histologische und immunhistochemische Untersuchungen asserviert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Entwicklung von Endometrioseherden aus 72h-präkultivierten Uterusfragmenten nahezu vollständig ausblieb. Weiterhin hemmte eine Präkultivierung über 24h die Entstehung von Endometrioseherden. Jedoch wurde das Wachstum einzelner Herde gefördert. Immunhistochemisch konnte nachgewiesen werden, dass die Mikrogefäßdichte sowie der Anteil GFP-positiver Blutgefäße und die Apoptoserate in Herden aus frisch isolierten und 24h-präkultivierten Fragmenten vergleichbar war, der Anteil proliferierender Stromazellen in Herden der 24h-präkultivierten Fragmente jedoch signifikant erhöht. Des Weiteren zeigte sich in den präkultivierten Uterusfragmenten ein signifikant geringerer Anteil an neutrophilen Granulozyten und Makrophagen.
In einem dritten Studienabschnitt wurden frisch isolierte sowie 24h- und 72h-präkultivierte Endometriumfragmente im Modell der Rückenhautkammer mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass eine Präkultivierung über 24h die Vaskularisierung von Endometriumfrag-menten fördert, während fast alle 72h-präkultivierten Endometriumfragmente keine Endometrioseherde mehr ausbilden konnten.
Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass die durch eine Präkultivierung verursachte Gewebehypoxie einen wesentlichen Einfluss auf die Integrität, das Überleben sowie die angiogene und proliferative Aktivität von ektopem Endometrium hat. Nach 72h Präkultivierung regrediert das Gewebe nahezu vollständig und ist nicht mehr in der Lage anzuwachsen und sich zu Endometrioseherden zu entwickeln. Im Gegensatz dazu fördert die 24h avaskuläre Periode die Überexpression von angiogenen Wachstumsfaktoren im Gewebe, was zur Ausbildung von Endometrioseherden mit aggressiverem Wachstum führt. Daher könnte die Dauer des ischämischen Zeitfensters einen wichtigen Selektionsfaktor für ektopes Endometrium darstellen, der die Entwicklung von Endometrioseherden innerhalb der Peritonealhöhle bestimmt.Endometriosis is defined as the presence of endometriotic lesions outside the uterine cavity. The primary cause of peritoneal endometriosis is retrograde menstruation. During menstruation, shed endometrium is retrogradely transported through the fallopian tubes into the peritoneal cavity. There, the tissue can adhere and proliferate and engraft into the peritoneum.
Retrograde menstruation is a physiological process, which occurs in up to 90 % of women. However, considerably less women suffer from endometriosis. Thus, other cofactors seem to be necessary to the development of the disease. In this context, it should be considered that in women the passage of shed endometrial fragments from the uterus into the peritoneal cavity and their final engraftment may require several hours to days. During this period, the fragments are avascular and exposed to hypoxic conditions. By now, it is completely unknown, how this affects the survival, proliferation, angiogenesis and inflammatory activity of the tissue and, hence, its ability of developing into endometriotic lesions.
Therefore the aim of the present thesis was to analyze, how the ischemic time window between the explantation and peritoneal contact of endometrium determines the formation, growth, angiogenesis, apoptosis and immune cell infiltration of induced endometriotic lesions.
In a first part of the thesis, uterine fragments from transgenic C57BL/6-TgN(ACTB-EGFP)1Osb/J mice with green fluorescent protein (GFP)-positive tissue were examined directly after their isolation or after precultivation for 24h or 72h by means of histology and immunohistochemistry. The cell density and microvessel density were significantly lower and the apoptosis rate was significantly higher in 72h-precultivated fragments when compared to freshly isolated and 24h-precultivated ones. In addition, a proteome-profiler-mouse-angiogenesis-array was performed to detect angiogenesis-related proteins. All analyzed proteins were detectable in cultivated and non-cultivated uterine fragments. However, the precultivated fragments exhibited a con-siderably different protein expression pattern when compared to the freshly isolated ones.
In a second part of the thesis, freshly isolated and precultivated uterine fragments of C57BL/6-TgN(ACTB-EGFP)1Osb/J-mice were transplanted to the abdominal wall of female C57BL/6 mice. To analyze the growth of these grafts, high-resolution ultra-sound imaging was performed repetitively over 28 days. At the end of the observa-tion period, the endometriotic lesions were excised for further histological and immunohistochemical analyses. It was found that the development of 72h-precultivated uterine fragments into endometriotic lesions was markedly suppressed. Furthermore, a precultivation for 24h also inhibited the development of endometriotic lesions. However, it promoted the growth of individual lesions. The microvessel density, the frac-tion of GFP-positive blood vessels and the rate of apoptosis were comparable in lesions developing from freshly isolated and 24h-precultivated fragments, whereas stromal cells showed a significantly higher proliferation rate in lesions of the 24h-precultivated grafts. The number of macrophages and granulocytes was significantly lower in lesions of precultivated uterine fragments.
In a third part of the thesis, freshly isolated as well as 24h- and 72h-precultivated endometrial fragments were analyzed in the dorsal skinfold chamber model by means of intravital fluorescence microscopy. By this, it could be shown that precultivation of endometrial fragments for 24h promotes their vascularization. In contrast, most of the 72h-precultivated endometrial fragments were not able to develop into endometriotic lesions.
In summary, the present thesis demonstrates that hypoxia induced by precultivation has a strong impact on the integrity, survival as well as the angiogenic and proliferative activity of ectopic endometrium. After 72h of precultivation, the tissue completely regresses and is no longer capable of engrafting and developing into endometriotic lesions. In contrast, an only 24h avascular period promotes the overexpression of angiogenic growth factors in the tissue, leading to the formation of endometriotic lesions which exhibit an aggressive growth behaviour. Therefore, it can be concluded that the duration of the ischemic time window may represent an important selection factor for ectopic endometrium, which determines the development of endometriotic lesions within the peritoneal cavity
