Early and accurate disease detection is critical for clinical diagnosis and ultimately
determining patient outcomes. Point-of-care testing (POCT) platforms are needed in low-
resource settings and also to help the decentralisation of healthcare centres. Immunoas-
says using Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) are especially interesting for
their increased sensitivity and specificity. Additionally, SERS can be easily translated
into POCT formats with microfluidics. In this work, a sensitive, selective, capable of
multiplexing, and reusable SERS-based biosensor was developed. The SERS immunoas-
say relies on a sandwich format, whereby a capture platform and SERS immunotags can
capture and detect a specific antigen, respectively. The SERS immunotags consisted of
gold nanostars, allowing exceptionally intense SERS signals from attached Raman re-
porters, and the covalent attachment of antibodies provided a stable antigen-antibody
binding activity. As a capture platform, a regenerated cellulose-based hydrogel provided
a robust design and the added advantage of environmental friendliness. Besides being a
transparent material with low background fluorescence and Raman signal, its high-water
retention capacity was particularly suited for preserving the high activity of covalently
bound antibodies, improving the assay time-stability. This SERS-based immunoassay was
then integrated into a microfluidic device, allowing high-throughput sample screening
allied with the high sensitivity and multiplexing features of the developed assay. The de-
vice was fabricated in less than 30 minutes by exploring direct patterning on shrinkable
polystyrene sheets for the construction of adaptable complex three-dimensional microflu-
idic chips. Finally, to validate the microfluidic system, Plasmodium falciparum infected
red blood cell culture samples were tested for malaria biomarker detection. The discrimi-
nation of SERS immunotags signals from the background was made through the direct
classical least squares method. As a result, better data fitting was achieved, compared
to the commonly used peak integral method. Considering these features, the proposed SERS-based immunoassay notably improved the detection limits of traditional enzyme-
linked immunosorbent assay approaches. Its performance was better or comparable to
existing SERS-based immunosensors. Moreover, this approach successfully overcame the
main challenges for application at POCT, including increasing reproducibility, sensitivity,
and specificity. Hence, the microfluidic SERS system represents a powerful technology
which can contribute to early diagnosis of infectious diseases, a decisive step towards
lowering their still substantial burden on health systems worldwide.A detecção precoce e precisa de doenças é fundamental para o diagnóstico clínico de-
terminando frequentemente o prognóstico do paciente. Desta forma, plataformas de teste
de rastreio (conhecidos pelo acrónimo de POCT) são extremamente necessárias, não só em
locais com poucos recursos, mas também para ajudar à descentralização dos cuidados de
saúde. Os ensaios imunológicos que utilizam a espectroscopia de Raman aumentada pela
superfície (conhecida pelo acrónimo de SERS) são particularmente interessantes pela sua
elevada sensibilidade. Além disso, os ensaios em SERS podem ser facilmente convertidos
para formatos POCT quando combinados com microfluídica. Este trabalho consistiu no
desenvolvimento de um biosensor sensível, selectivo, capaz de múltipla detecção e reuti-
lizável baseado no fenómeno de SERS. O ensaio imunológico em SERS foi realizado num
formato em sanduíche onde um antigénio específico é apreendido por uma plataforma
de captura e reconhecido por imunosondas activas em SERS. Estas sondas consistem em
nanopartículas de ouro em forma de estrela, que proporcionam um sinal de SERS intenso
proveniente das moléculas repórter de Raman ligadas às nanopartículas. As sondas ad-
quirem a especificidade necessária para o antigénio de anticorpos a elas ligados de forma
covalente, e, por conseguinte, permitem uma ligação estável antigénio-anticorpo. O hidro-
gel regenerado à base de celulose forneceu uma plataforma de captura de design robusto
e ecológico. Além de ser um material transparente com baixa fluorescência e, portanto,
de baixa interferência no sinal de Raman, é um material com uma elevada capacidade de
retenção de água tornando-o particularmente adequado para preservar a actividade dos
anticorpos ligados covalentemente. Deste modo, o hidrogel proporciona uma plataforma
de captura estável ao longo do tempo. O immunoensaio baseado em SERS desenvolvido
foi posteriormente integrado num dispositivo de microfluídica, permitindo analisar um
grande número de amostras sendo simultaneamente sensível e passível para aplicações
de análise de múltiplos antigénios. O dispositivo foi fabricado em menos de 30 minu-
tos devido à padronização directa em folhas de poliestireno contrácteis possibilitando a construção tridimensional de um dispositivo de microfluídica. Finalmente, para validar
o sistema de microfluídica, amostras de cultura de eritrócitos infectados com Plasmodium
falciparum foram testadas para detecção de biomarcadores de malária. A discriminação
dos sinais das immunosondas activas em SERS, relativamente a sinais interferentes, foi
feita através do método clássico de quadrados mínimos. Como resultado, foi conseguido
um melhor ajuste de dados em comparação com o método de cálculo do integral das
áreas das bandas habitualmente utilizado. Assim, o ensaio imunológico baseado em SERS
proposto neste trabalho permitiu obter um limite de detecção mais baixo do que o obtido
pelas abordagens tradicionais como o ensaio de imunoabsorção enzimática (conhecido
pelo acrónimo de ELISA), além de exibir um desempenho melhor ou comparável a ou-
tros sensores baseados em SERS já existentes na literatura. Adicionalmente, o sistema
desenvolvido neste trabalho permite ultrapassar desafios que impedem a utilização deste
tipo de sensores em locais de poucos recursos, apresentando valores elevados de repro-
dutibilidade, sensibilidade e especificidade. Por conseguinte, um sistema que combina
SERS e microfluídica representa uma tecnologia potencialmente importante na detecção
precoce, na esperança de que, num futuro próximo, as consequências das doenças infecci-
osas que ainda impõem um fardo substancial ao sistema de saúde a nível mundial, sejam
minoradas