Wróbel, Paulina

Polish

Jagiellonian Univeristy Repository

1  STRESZCZENIE ROZPRAWY DOKTORSKIEJ „Badania strukturalne oddziaływania wybranych związków trójcyklicznych z nowymi wariantami β-laktoglobuliny posiadającymi modyfikacje w rejonie kieszeni wiążącej”  („Structural studies of the interaction of tricyclic compounds with new β-lactoglobulin variants possessing a modifications in the binding site region”)  Uniwersytet Jagielloński w Krakowie   Paulina Wróbel   Praca wykonana w Zakładzie Krystalochemii i Krystalofizyki UJ w Zespole Biokrystalografii  pod kierunkiem prof. dr hab. Krzysztofa Lewińskiego  oraz dr Joanny Loch    Kraków 2022  2  Wołowa β-laktoglobulina (BLG) należy do rodziny lipokalin – różnorodnych, małych białek, które zazwyczaj przechowują lub transportują wrażliwe chemicznie oraz słabo rozpuszczalne związki biologiczne. Lipokaliny charakteryzują się prostą architekturą,  a wykorzystując inżynierię genetyczną w połączeniu z technikami selekcji molekularnej można modyfikować te białka, a tym samym zmieniać ich selektywność i powinowactwo do ligandów. Jak w większości lipokalin, głównym miejscem wiązania BLG jest hydrofobowe wnętrze β-baryłki. Wprowadzenie mutacji we wnętrzu baryłki pozwala na uzyskanie białek, o zmienionych właściwościach wiązania i powinowactwie do ligandów. Celem pracy było zaprojektowanie i otrzymanie nowych wariantów β-laktoglobuliny  o zmienionym kształcie kieszeni wiążącej, a następnie zbadanie jak wybrane mutacje wpływają na zdolność oddziaływania białka z testowanymi ligandami o niewielkiej masie cząsteczkowej. Stosując ukierunkowaną mutagenezę otrzymano nowe warianty BLG: F105L/L39A/M107W (LAW), I56F/L39A/M107W (FAW), I56F/L39A/I71W (FA71W) oraz L58F/V92Y (58F/92Y), które zostały zaprojektowane tak, aby dodatkowe reszty aromatyczne wprowadzone w rejonie hydrofobowej kieszeni wiążącej sprzyjały rozpoznawaniu i wiązaniu leków, które zawierają fragmenty aromatyczne. Jako modelowe ligandy wybrano głównie cząsteczki o geometrii trójcyklicznej m.in. leki przeciwpsychotyczne i antydepresyjne, które są często przedawkowywane w próbach samobójczych. Można je podzielić na cztery grupy: (1) leki trójcykliczne z łańcuchem alifatycznym: amitryptylina (AMT), klomipramina (CLO), doksepina (DOX), (2) leki trójcykliczne zawierające cykliczny fragment alifatyczny: ketotifen (KET), amoksapina (AMX), (3) ligandy zawierające ugrupowanie fenotiazynowe: flufenazyna (FLU), chloropromazyna (CPZ) oraz (4) cetyryzyna (CET). Wszystkie nowe warianty testowano również pod kątem ich powinowactwa do nasyconych kwasów tłuszczowych (palmitynowego lub mirystynowego), które są uznawane za naturalne ligandy BLG.  Badania prowadzono na rekombinowanych białkach, otrzymanych w wyniku produkcji w bakteryjnych systemach ekspresyjnych. Białka oczyszczano metodami chromatograficznymi z użyciem złoża Fractogel oraz Sephadex i krystalizowano metodą dyfuzji przez fazę gazową, techniką wiszącej kropli. Przy optymalizacji procesu krystalizacji korzystano z tradycyjnych metod, takich jak zmiana stężenia białka  i precypitantów. Pomiary dyfrakcji wykonane zostały przy użyciu dyfraktometrów Supernova i Synergy-S (Rigaku Oxford Diffraction) oraz promieniowania synchrotronowego. 3  Dobrej jakości kryształy, odpowiednie do pomiarów dyfraktometrycznych otrzymano dla prawie wszystkich kompleksów białko-ligand. Przeprowadzone badania krystalizacyjne pokazały, że najlepsze warunki do wzrostu dobrej jakości kryształów to 2,4-2,8 M siarczan amonu w 0,5 M Tris-HCl pH 8,5. Dla badanych kompleksów otrzymano trygonalne kryształy o symetrii grupy przestrzennej P3221, które w jednostce asymetrycznej zawierały pojedynczy łańcuch białkowy. We wszystkich otrzymanych kompleksach, ligand związany był we wnętrzu zmodyfikowanej β-baryłki.  Analiza struktur kompleksów wykazała, że kształt kieszeni wiążącej w formie apo nowych wariantów BLG, zawierających reszty tryptofanowe w zmodyfikowanej β-baryłce determinuje selektywność wiązania ligandów. Najmniej selektywnym wariantem BLG, wiążącym niemal całą grupę testowanych w ramach tej pracy ligandów (AMT, CLO, DOX, KET, FLU i CPZ) okazał się wariant FAW. Wiązanie ligandów we wnętrzu FAW nie powoduje zmian konformacyjnych łańcuchów bocznych aminokwasów, co świadczy o tym, że kieszeń wiążąca posiada geometrię zdolną do akomodacji pojedynczej cząsteczki leku  z przebadanej grupy związków trójcyklicznych. Najbardziej selektywnym wariantem okazał się wariant LAW, który wiązał jedynie związki z grupy 3, czyli ligandy zawierające ugrupowanie fenotiazynowe: flufenazynę (FLU) oraz chloropromazynę (CPZ). W formie apo tego wariantu zauważono, że wyjściowa pozycja Trp107 znacznie spłaszcza miejsce wiążące i blokuje dostęp do hydrofobowego wnętrza baryłki. Cząsteczka chloropromazyny dopasowała się do kształtu kieszeni, natomiast znacznie większy układ trójpierścieniowy flufenazyny z przyłączoną grupą -CF3 wymusił zmianę konformacyjną Trp107. Wariant FA71W wykazał selektywność pośrednią pomiędzy LAW i FAW. Związanie liganda wymuszało zmiany pozycji, ale bez zmiany konformacji łańcucha bocznego Trp71. Taką zmianę generowały ligandy z relatywnie sztywnym układem trójpierścieniowym (ligandy z grupy 2, 3 oraz CET). Ligandy z grupy 1 (AMT, CLO, DOX) nie były na tyle sztywne aby być stabilnie związane we wnętrzu baryłki FA71W. Wśród badanych kompleksów wariantu 58F/92Y obecność liganda potwierdzono jedynie w strukturze kompleksu z amoksapiną. Analiza wyników pokazała, że kieszeń wiążąca wariantu 58F/92Y jest mniej elastyczna niż w pozostałych badanych wariantach BLG. Mutacje L58F oraz V92Y zlokalizowane są w sposób uniemożliwiający zmiany konformacyjne łańcuchów bocznych, a tym samym dopasowanie się kieszeni wiążącej do kształtu liganda. Mutant 58F/92Y akceptuje jedynie cząsteczki, które pasują kształtem  i wielkością do architektury kieszeni wiążącej.   4  Jednym z celów wprowadzonych mutacji było skrócenie kieszeni wiążącej, a tym samym uniemożliwienie wiązania kwasów tłuszczowych, uznawanych za naturalne ligandy BLG. Uzyskane wyniki jasno pokazały że wybrane do tej pracy mutacje wprowadzone  w kieszeni wiążącej BLG, zmieniają nie tylko jej geometrię ale również powinowactwo do ligandów. Białko krystalizowane w obecności kwasów tłuszczowych nie związało liganda  w miejscu wiążącym. Obecne w cytoplazmie podczas ekspresji, bądź też pochodzące  z uszkodzonych błon komórkowych na etapie oczyszczania kwasy tłuszczowe nie mogą spontanicznie wiązać się w kieszeni wiążącej nowych wariantów BLG, a tym samym nie zaburzają procesu wiązania docelowych ligandów, czyli trójcyklicznych leków. Wprowadzone mutacje zapobiegają zatem temu zjawisku i zwiększają prawdopodobieństwo związania cząsteczki leków. Podstawową metodą badawczą zastosowaną w tej pracy była krystalografia rentgenowska. Spektroskopia dichroizmu kołowego (CD), która umożliwiła oszacowanie stałej dysocjacji (Kd) dla wybranych kompleksów białko-ligand oraz różnicowa fluorescencja w skali nano (nanoDSF), umożliwiająca wyznaczenie stabilności termicznej (Tm) mutantów stanowiły uzupełnienie tej metody. Powinowactwo wiązania liganda przez białko wyrażona została wartością Kd. Otrzymane wyniki pokazały, że wartości te są indywidualną właściwością pary białko-ligand zależną od rodzaju i ilości oddziaływań,  a także komplementarności kształtu β-baryłki i liganda. Najwyższe powinowactwo oraz specyficzność wiązania odnotowano dla kompleksów FA71W-FLU oraz FA71W-CPZ,  w których potwierdzono obecność relatywnie specyficznych oddziaływań R-Cl···π oraz  R-CF3···π przy jednoczesnej obecności oddziaływań π···π (edge-to-face) pomiędzy cząsteczką liganda a resztami białka. Pomiary termostabilności pokazały, że na stabilność termiczną nowych wariantów BLG silny wpływ mają mutacje wprowadzone w środkowej części β-baryłki; mutacje I56F oraz V92Y silnie obniżają stabilność białka. Zastąpienie Phe107 leucyną wpływa stabilizująco na białko i zwiększa jego temperaturę denaturacji. Rekombinowane białka są rosnącą grupą innowacyjnych środków terapeutycznych. Przedstawione w tej pracy nowe warianty BLG, szczególnie FAW oraz FA71W wydają się obiecującymi nośnikami leków. Posiadają one unikalną kombinację właściwości, które mogą stanowić świetną bazę do dalszych badań nad selektywnością wiązania ligandów. Zwiększenie termostabilności tych wariantów wymaga dalszej pracy, co pozwoli zwiększyć prawdopodobieństwo ich potencjalnego zastosowania w medycynie.   

Structural studies of the interaction of tricyclic compounds with new β-lactoglobulin variants possessing a modifications in the binding site region

https://ruj.uj.edu.pl/xmlui/bitstream/handle/item/305869/wrobel_streszczenie_rozprawy_doktorskiej_2022.pdf?sequence=2&isAllowed=y

Structural studies of the interaction of tricyclic compounds with new β-lactoglobulin variants possessing a modifications in the binding site region

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Jagiellonian Univeristy Repository