Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε η ύπαρξη κυκλικών RNAs του γονιδίου BAX σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Το συγκεκριμένο γονίδιο κωδικοποιεί την πρωτεινη BAX, μια προαποπτωτική πρωτεινη, μέλος της οικογένειας Bcl2, η οποία έχει ως κύρια λειτουργία τον σχηματισμό πόρων στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβρανη, ώστε να εξέλθει το κυτόχρωμα c από το μιτοχόνδριο. Το βήμα αυτό αποτελεί το καθοριστικό βήμα του ενδογενούς μονοπατιού της απόπτωσης, σημαίνοντας πως η πρωτεινη BAX αποτελεί κύριο ρυθμιστή της ιδιαίτερα σημαντικής διαδικασίας του κυτταρικού θανάτου.
Τα κυκλικά RNA είναι μια κατηγορία μονόκλωνων RNA, που σε αντίθεση με τα γραμμικά RNA, έχουν ομοιοπολικά συνδεδεμένα τα 5’ και 3’ άκρα τους, σχηματίζοντας ένα κλειστό κυκλικό σχήμα. Παράγονται από μια μη κανονική διαδικασία συρραφής, την οπισθοσυρραφή. Έχει φανεί πως έχουν μια πληθώρα λειτουργιών, καθώς μπορούν να λειτουργούν ως ρυθμιστές της μεταγραφής, πρωτεϊνικά ικριώματα, σπόγγοι miRNAs και RBPs, όπως και να μεταφράζονται. Έχει βρεθεί επίσης να παίζουν ρόλο στον καρκίνο με ποικίλους μηχανισμούς, ρυθμίζοντας διάφορα κυτταρικά μονοπάτια και αλληλοεπιδρώντας με πρωτεΐνες και άλλα μόρια RNA.
Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε η παρουσία κυκλικών RNA, προερχόμενων από το γονίδιο BAX σε 7 κυτταρικές σειρές, οι 6 από τις οποίες ήταν καρκινικές. Η διαδικασία αποτελούνταν από την απομόνωση RNA, τον φωτομετρικό προσδιορισμό της συγκέντρωσης του, την εφαρμογή των μεθόδων της αντίστροφης μεταγραφής, της επάλληλης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, την απομόνωση ζωνών ενδιαφέροντος και την αλληλούχιση κατά Sanger.
Αποτέλεσμα ήταν η εύρεση τριών νέων κυκλικών RNA από τις καρκινικές σειρές μαστού MCF-7 και SK-BR-3, το οποίο μελετήθηκε περαιτέρω με χρήση βιοπληροφορικών εργαλείων. Αναλυτικότερα, πραγματοποιήθηκε πρόβλεψη των πιθανών αλληλεπιδράσεων των μορίων αυτών με miRNAs καθώς και με πρωτεΐνες, αλλά και πρόβλεψη ύπαρξης ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης και εσωτερικών θέσεων πρόσδεσης ριβοσωμάτων.
Η λειτουργία και τα ιδιαιτέρα χαρακτηριστικά αυτών των κυκλικών RNA είναι δυνατόν στη συνέχεια να προσδιοριστούν με μεγαλύτερη λεπτομέρεια, ώστε να αναδειχθεί ο ρόλος τους στον καρκίνο και πιθανώς σε άλλες παθολογικές καταστάσεις, καθώς και ο τρόπος που εμπλέκονται στις διάφορες διαδικασίες του κυττάρου.The existence of circRNAs deriving from BAX gene was studied in human cancer cells. This particular gene encode protein BAX, a proapoptotic member of the Bcl2 family, which formes pores on the outer mitochondrial membrane in order for cytochrome c to be released from mitochondrion. This step is a crucial step in the intrinsic pathway of apoptosis, so BAX functions as a regulator of this very important process of programmed cell death.
CircRNAs are a category of single-stranded RNA, which have covalently linked their 5' and 3' ends, forming a closed structure. They are produced by a non-canonical form of splicing, called backsplicing. They have a lot of functions, since they can regulate transcription, acts as protein scaffolds or miRNA sponges and be translated. They also are implicated in cancer, regulating several pathways and interacting with proteins and other RNA molecules.
In this study the presence of circRNA was researched in 7 cell lines, 6 of which were cancer cell lines. As a result 3 new circRNAs were found from cancer cell lines MCF-7 and SK-BR-3, which were further studied with the use of bioinformatic tools. More presicely, a prediction of possible interactions with miRNAs as well as with proteins was made, and also prediction of possible ORFs and IRES.
The function and the special characteristics of these circRNAs can be further determined, for their role in cancer and other diseasesto be elucidated, as well as the mechanism by which they are implicated in the different cellular processes
