Prostate cancer (PC) is the fifth leading cause of death worldwide and the second most diagnosed malignancy in men, being the leading cause of death in the Colombian male population. Prostate cancer cells show abnormal metabolic and redox activity, and emerging evidence indicates that the behavior of this type of cancer has been related to aggressive tumor characteristics such as chemoresistance, invasiveness, and metastatic potential, among others. In addition, drugs used in clinical oncology have narrow therapeutic indexes with adverse toxicity, often involving oxidative damage to normal tissues. Docetaxel (DCT) is an antineoplastic drug used to treat PC; its cytotoxicity and emerging resistance have limited its efficacy. Combination therapies are intended to sensitize tumors and protect unaffected tissues, which increases the therapeutic index. Sulforaphane (SFN) is a phytochemical of broad clinical interest due to its anticancer properties and promising effects in combination therapies. Consequently, the present research aimed to evaluate the therapeutic efficacy of SFN and DCT on an in vitro model of PC with different sensitivity to chemotherapy as an antitumor strategy. In this experimental-type investigation, PC cell lines with different levels of tumorigenicity and chemoresistance, as well as the non-tumorigenic counterpart, were used to offer different redox and metabolic characteristics. RWPE-1, LNCAP, and PC3 cell lines were seeded at a density of 5x103 cells/well in 96-well culture plates and treated with SFN and DCT for 72 h to determine effects on viability, mitochondrial activity, and cell death. Possible interactions of treatments were analyzed by isobologram analysis at 48 h. At the same time, promising mean concentrations in a combination of IC50 of SFN and DCT were evaluated for their effect on glycolytic and redox metabolism by analysis of glucose consumption and lactate production, intracellular levels of Reactive Oxygen Species (ROS), relative mitochondrial mass; the antioxidant status with the measurement of reduced (GSH) and oxidized (GSSG) Glutathione, finally the expression of SOD2 and LDHA genes regulated by Nrf2 and HIF1- α. The results obtained showed reduced viability of LNCAP and PC3
tumor cells after SFN and DCT treatments in a dose- and time-dependent manner. Lower sensitivity to treatments was observed in non-tumor RWPE-1 cells. Isobologram analysis indicated a possible synergistic effect between SFN and DCT. SFN IC50s showed mitochondrial activity measured by MTT in tumor cells. The combination of SFN and DCT triggered apoptosis in tumor models by inducing an increase in ROS levels, an increase in mitochondrial mass in LNCAP cells, a down-regulation of LDHA, and a decrease in lactate levels. Despite the induction of apoptosis by the treatments in PC3 cells, no significant chemo sensitization of redox and glycolytic metabolism was observed, suggesting the existence of differences in the glycolytic pathway of the tumor cell models, as well as an essential antioxidant defense system that could be evading cell death induced by the combination treatments, the findings of this study could link other sensitization pathways that modulate the viability or death of these cells. These results are the first to demonstrate effects on redox and glycolytic metabolism of SFN and DCT interaction in CP cells.LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ 7LISTA DE TABLAS.............................................................................................................. 8LISTA DE ANEXOS ............................................................................................................. 8RESUMEN............................................................................................................................. 9ABSTRACT ......................................................................................................................... 11INTRODUCCIÓN................................................................................................................ 13MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES ......................................................................... 17Etiología y patología del cáncer de próstata .....................................................................17La quimioterapia del cáncer de próstata ...........................................................................19Estrés Oxidativo y el cáncer de próstata ...........................................................................20Metabolismo del cáncer de próstata..................................................................................22Fitoquímicos en el tratamiento del cáncer de próstata: Sulforafano.................................25OBJETIVOS......................................................................................................................... 27Objetivo general................................................................................................................27Objetivos específicos........................................................................................................27MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................................. 28Área y tipo de estudio .......................................................................................................28Cultivos celulares..............................................................................................................28Ensayo de viabilidad por Cristal violeta ...........................................................................29Ensayo de MTT [bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio)] .............30Detección y caracterización de la apoptosis .....................................................................31Ensayo de muerte celular por Anexina V .........................................................................31Actividad caspasas 3, 8 y 9...............................................................................................31Evaluación de los efectos combinados SFN y DCT mediante análisis de isobologramas ............32Caracterización de los tratamientos combinados SFN y DCT sobre el estado redox y metabólico.........................................................................................................................32Consumo de glucosa y fermentación láctica.....................................................................32Caracterización redox .......................................................................................................34Determinación de ROS intracelular..................................................................................34Masa mitocondrial relativa ...............................................................................................34Determinación de GSH, GSSG y la relación GSH/GSSG................................................35Niveles de expresión (ARNm) de genes regulados por Nrf2, y HIF-1.............................36Análisis estadístico ...........................................................................................................36RESULTADOS .................................................................................................................... 37DISCUSIÓN......................................................................................................................... 51CONCLUSIONES................................................................................................................ 59REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................................. 60ANEXOS.............................................................................................................................. 70El cáncer de próstata (CP) es la quinta causa de muerte a nivel mundial y la segunda neoplasia maligna mayormente diagnosticada en hombres, siendo la principal causa de muerte en la población masculina colombiana. Las células cancerosas de próstata muestran una actividad metabólica y redox anormal, y la evidencia emergente indica que el comportamiento de este tipo de cáncer se ha relacionado con características tumorales agresivas como la quimiorresistencia, invasividad y potencial metastásico, entre otras. Además, los medicamentos utilizados en oncología clínica tienen índices terapéuticos estrechos con toxicidad adversa, que a menudo implica daño oxidativo en los tejidos normales. El Docetaxel (DCT) es un fármaco antineoplásico, utilizado para el tratamiento de CP, su citotoxicidad y emergente resistencia han limitado su eficacia. Las terapias de combinación tienen el propósito de sensibilizar los tumores y proteger tejidos no afectados lo aumenta el índice terapéutico. El Sulforafano (SFN), es un fitoquímico de amplio interés clínico, debido a sus propiedades anticancerígenas y efectos promisorios en terapias de combinación. En consecuencia, la presente investigación tuvo como objetivo evaluar la eficacia terapeutica de SFN y DCT sobre un modelo in vitro de CP de diferente sensibilidad a quimioterapia como estrategia antitumoral. En esta investigación de tipo experimental, se usaron líneas celulares de CP con diferentes niveles de tumorigenicidad y quimioresistencia, así como la contraparte no tumoral, de modo que ofrecieran diferentes características redox y metabólicas. Las líneas celulares RWPE-1, LNCAP y PC3 se sembraron a una densidad de 5x103 células/pozo en placas de cultivo de 96 pozos y fueron tratadas con SFN y DCT durante 72 h para la determinación de los efectos sobre la viabilidad, la actividad mitocondrial y la muerte celular. Se analizaron las posibles interacciones de los tratamientos mediante un análisis de isobologramas a las 48 h, a su vez se evaluaron las concentraciones medias promisorias en combinación de IC50 de SFN y DCT su efecto sobre el metabolismo glucolítico y redox, mediante el análisis de consumo de glucosa y producción de lactato, los niveles intracelulares de Especies Reactivas de Oxígeno (ROS), la masa mitocondrial relativa; el estado antioxidante con la medición de Glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG), finalmente la expresión de genes SOD2 y LDHA regulados por Nrf2 e HIF1- α. Los resultados obtenidos mostraron una viabilidad reducida de las células tumorales LNCAP y PC3 tras los tratamientos de SFN y DCT de manera dependiente de la dosis y el tiempo. En las células RWPE-1 no tumorales se observó una menor sensibilidad a los tratamientos. El análisis de isobologramas indica un posible efecto sinérgico entre SFN y DCT. Los IC50 SFN, mostraron una actividad mitocondrial medida mediante MTT en las células tumorales. La combinación SFN y DCT desencadenó apoptosis en los modelos tumorales; al inducir un incremento en los niveles de ROS, acompañado de un aumento de la masa mitocondrial en las células LNCAP y una regulación a la baja de LDHA y disminución en los niveles de lactato. Pese a la inducción de apoptosis por los tratamientos en las células PC3, no se observó una quimio sensibilización del metabolismo redox y glucolítico significativo, lo sugiere la existencia de diferencias en la vía glucolítica de los modelos celulares tumorales, así como un importante sistema de defensa antioxidante que podría estar evadiendo la muerte celular inducida por los tratamientos en combinación, los hallazgos de este estudio podrían vincular otras vías de sensibilización que modulen la viabilidad y/o muerte de estas células. Estos resultados son los primeros en demostrar efectos sobre el metabolismo redox y glucolítico de la interacción de SFN y DCT en las células de CP.MaestríaMagíster en BiotecnologíaTrabajos de Investigación y/o Extensió
