DNA next generation sequencing to identify genetics abnormalities involved in developmental disorders with prenatal onset

Abstract

Introduction : Les anomalies du développement (AD) sont caractérisées par une déficience intellectuelle (DI), un retard de croissance staturo-pondéral, une ou plusieurs malformation(s) congénitale(s) (MC), dont les particularités morphologiques faciales, qui peuvent-être identifiées avant la naissance. Elles compliquent environ 3% des naissances et sont responsables d’une morbi-mortalité majeure (20% des mort-nés, 10% de la mortalité néonatale et de 3 millions de handicap par an). Les AD sont majoritairement secondaires à des causes génétiques dont certaines sont associées à un risque de récurrence. En pratique clinique, les investigations conventionnelles conduisent à un diagnostic dans un tiers des cas. Le développement des techniques de séquençage nouvelle génération de l’ADN (NGS) est donc une opportunité pour élucider les bases moléculaires de ces pathologies rares et hétérogènes. Notre objectif était d’utiliser le NGS pour identifier les bases moléculaires de fœtus atteints de MC inexpliquées sur le plan moléculaire.Matériel et Méthodes : Nous avons utilisés deux approches différentes en fonction du phénotype fœtal : une approche pangénomique par séquençage d’exome (ES) pour les cas présentant un syndrome polymalformatif (cohorte « FOETEX ») et le séquençage ciblé pour les cas présentant des MC en mosaïque (cohorte « MOSAIQUE »). Au sein de la cohorte « FOETEX », nous avons réanalysé à partir des données anténatales les données d’ES solo pour lesquelles un variant de classe III à V avait été identifié par l’analyse après autopsie. Ensuite nous avons réalisé un ES en trio chez 30 cas pour lesquels l’ES solo après autopsie n’avait pas identifié de mutations pathogènes. Au sein de la cohorte « MOSAIQUE », nous avons réalisé un séquençage ciblé en profondeur des gènes de la voie PI3K-AKT-mTOR.Résultats : La réanalyse des données d’ES à partir des données anténatales a conduit au diagnostic dans 100% des cas (92% grâce à un ES en solo et 8% avec un ES en trio). Pour les 30 cas où nous avons réalisés un ES en trio, la réanalyse des données d’ES pour les gènes connus en pathologie humaine (OMIM) n’a pas identifié de variant de classe 4/5 et a identifié 2 variants de classe 3 (NXN, FRAS1). L’analyse étendue à l’ensemble de l’ES a permis d’identifier quatre gènes candidats robustes (WDR91, DNAH2, SEPT2 et PRPF19). 18 autres variations dans des gènes non rapportés en pathologie humaine ont été identifié. Le partage international de données n’a pas pu permettre de soutenir leur pathogénicité potentielle à l’heure actuelle (« absence de match » pour 4 cas et « match non-concluant » pour 14 cas). Le séquençage ciblé en profondeur a permis de conduire à un diagnostic dans 20/21 cas, avec une implication majoritaire des mutations pathogènes de PIK3CA, impliquées dans le spectre PROS.Conclusion : L’ES en trio semble être une technique performante pour identifier les bases moléculaires des MC, dès la période anténatale. Cependant de nombreuses limites du NGS, dont la plupart non spécifiques aux cas fœtaux, doivent encore être surmontées. L’accès aux tissus atteints semble être un des points clés des investigations moléculaires, à la fois pour les pathologies en mosaïque, mais également pour l’étude des variations transcriptomiques associées aux variations génomiques.Introduction: Developmental disorders (DD) are characterized by intellectual disability (ID), growth retardation, and at least one congenital malformation (CM), including dysmorphisms, which can be detected before birth. They affect about 3% of births and are associated with a high morbidity and mortality (20% of stillbirths, 10% of neonatal deaths and 3 million cases of disability per year). DD are mostly secondary to genetic abnormality, of which some are associated with a risk of recurrence. In clinical practice, conventional investigations lead to a diagnosis in only one third of cases. The development of DNA next generation sequencing (NGS) presents an opportunity to elucidate the molecular basis of these rare and heterogeneous disorders. Our aim was to use NGS to identify the molecular basis of fetuses with unexplained CM.Material and Methods: We used two different technologies depending on the fetal phenotype: exome sequencing (ES) for cases affected by multiple CM (FOETEX cohort) and ultra-deep targeted sequencing for cases affected by mosaicism (MOSAIC cohort). Within the FOETEX cohort, we blindly reanalyzed postmortem ES data using prenatal phenotype, only in fetuses harboring a (likely) pathogenic variant or a variant of unknown significance (by post-mortem analysis). Then, we performed a trio-ES in 30 cases with negative postmortem solo-ES. Within the "MOSAIC" cohort, we performed targeted ultra-deep sequencing of the PI3K-AKT-mTOR pathway genes.Results: Reanalysis of ES data using antenatal data led to a diagnosis in 100% of cases (92% with a solo-ES and 8% with a trio-ES). Regarding the 30 cases where we performed a trio ES, the reanalysis of ES data for genes known to be implicated in human pathology (OMIM) did not identify any class 4/5 variants and identified 2 class 3 variants (NXN, FRAS1). Further analysis of ES data identified four candidate genes (WDR91, DNAH2, SEPT2 and PRPF19). 18 other variations were identified in genes hitherto not associated with human pathology. Yet, their potential pathogenicity has not been identified according to international data sharing ("no match" for 4 cases and "inconclusive match" for the remaining 14). Targeted ultra-deep sequencing led to a diagnosis in 20 out of 21 cases, with a majority of pathogenic PIK3CA mutations, involved in the PROS spectrum.Conclusion: Trio-ES is a powerful tool to identify the molecular basis of CM. However, many limitations of NGS, most of which are not confined to fetal medicine, await resolution. Genetic tests on affected tissue may be performed to improve the diagnostic yield both for mosaic pathologies, as well as for the transcriptional study