In this study, the inhibiting activity of siderophores produced by Pseudomonas fluorescens against Escherichia coli O157:7 was assayed. Siderophores were extracted from P. fluorescens cultures and preliminarily tested by C.A.S. reagent and UV. The siderophores activity against E. coli O157:H7 was characterised by the determination of Minimal Inhibiting Concentration (MIC). Furthermore, E. coli O157:H7 growth tests with and without siderophores were prepared at 12°C, pH 7 and 5, aw 0.997 and 0,988. The MIC was assessed at 7 μg/ml whereas the growth test showed a high inhibiting activity with the exception of tests at pH 5

A. Giuffrida

D. Signorino

F. Giarratana

G. Ziino

L. Giordano

Italian Journal of Food Safety

English

In this study, the inhibiting activity of siderophores produced by Pseudomonas fluorescens against Escherichia coli O157:7 was assayed. Siderophores were extracted from P. fluorescens cultures and preliminarily tested by C.A.S. reagent and UV. The siderophores activity against E. coli O157:H7 was characterised by the determination of Minimal Inhibiting Concentration (MIC). Furthermore, E. coli O157:H7 growth tests with and without siderophores were prepared at 12&deg;C, pH 7 and 5, aw 0.997 and 0,988. The MIC was assessed at 7 &mu;g/ml whereas the growth test showed a high inhibiting activity with the exception of tests at pH 5

Directory of Open Access Journals

Italian Journal of Food Safety, Vol. 1 N. 4 Giugno 2012 57 VALUTAZIONE IN VITRO DELL’EFFETTO DI SIDEROFORI SU E. COLI O157:H7 EFFECT OF SIDEROPHORES AGAINST E. coli O157:H7 Giarratana F., Ziino G., Signorino D., Giordano L., Giuffrida A. Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria – Università di Messina SUMMARY In this study, the inhibiting activity of siderophores produced by Pseudomonas fluorescens against Escherichia coli O157:7 was assayed. Siderophores were extracted from P. fluorescens cultures and preliminarily tested by C.A.S. reagent and UV. The siderophores activity against E. coli O157:H7 was characterised by the determination of Minimal Inhibiting Concentration (MIC). Furthermore, E. coli O157:H7 growth tests with and without siderophores were prepared at 12°C, pH 7 and 5, aw 0.997 and 0,988. The MIC was assessed at 7 µg/ml whereas the growth test showed a high inhibiting activity with the exception of tests at pH 5. KEYWORDS siderophores, E.coli O157:H7, inhibiting activity, food safety. INTRODUZIONE I siderofori sono sostanze a basso peso moleco-lare (< 1KD), prodotte da diversi tipi di micror-ganismi e dalle piante, capaci di legare il Fe3+ e di facilitarne il trasporto intracellulare in fun-zione della loro idrosolubilità e di specifici recet-tori di membrana (1). In relazione alla elevata affinità con il ferro, sono considerati agenti che-lanti, poiché attraverso gli atomi di ossigeno le-gano e trasportano il ferro, formando un com-plesso molto stabile. Dal punto di vista struttu-rale, tali sostanze possono essere suddivise in catecolati, idrossamati, fenolati e carbossilasi, sebbene esistano forme chimiche più complesse come la Pioverdina, prodotta da alcune specie di Pseudomonas fluorescenti, definite Idrossicate-colati, poiché possiedono sia il gruppo funziona-le degli Idrossammati che quello dei Catecolati (1). La sintesi di tali molecole è finemente con-trollata da una cascata di regolatori trascrizio-nali positivi e negativi (2), che assicurano l’espressione dei geni da cui deriva la produzio-ne dei siderofori, in relazione alle esigenze nu-trizionali del microrganismo. In particolare, la bassa biodisponibilità di ferro nell’ambiente viene recepita da proteine sensori presenti a li-vello dello spazio periplasmatico, le quali atti-vano, mediante la scissione dell’ATP, meccani-smi genetici di produzione di tali sostanze (1). I siderofori così secreti, si legano al Fe3+ e detto complesso viene riconosciuto da specifici recet-tori cellulari situati nella membrana esterna (3). Nei funghi e in altri eucarioti il complesso ferro-sideroforo può essere ridotto a Fe++ a livel-lo extracellulare, mentre nella maggior parte dei casi l’intero complesso ferro-sideroforo è at-tivamente trasportato attraverso la membrana cellulare. Nei batteri Gram-, il complesso viene trasportato nel periplasma attraverso recettori TonB e viene successivamente trasferito nel ci-toplasma mediante trasportatori ABC (ATP-binding cassette transporters) (4). Gli ABC-transporter utilizzano l'energia di idrolisi dell'ATP per trasportare il complesso attraverso la membrana cellulare (5). Nel citoplasma il complesso rilascia il Fe+++ che viene ridotto en-zimaticamente (ferro-chelato reduttasi) a Fe++, divenendo quindi disponibile per le funzioni cel-lulari. Con meccanismi simili, i siderofori ven-gono inoltre utilizzati anche per il trasporto di altri microelementi, come il cobalto e il molib-deno (6). I suddetti complessi meccanismi di produzione, trasporto e utilizzo dei siderofori, fanno si che tali sostanze siano estremamente eterogenee, assolvendo alla necessità dei batteri di produrre composti strutturalmente differenti che i siste-mi di trasporto attivo specifici degli altri mi-crorganismi non siano in grado di riconoscere (7). Nonostante ciò, sono stati diversi i contribu-ti scientifici volti a dimostrare l’effetto inibente Italian Journal of Food Safety, Vol. 1 N. 4 Giugno 2012 58 di alcuni siderofori su varie specie di microrga-nismi (8, 9), in base alla possibilità che tali so-stanze, deprivate dal ferro, possano sottrarre questo elemento ai batteri inibendone dunque i sistemi enzimatici utili alla loro crescita. Ciò, soprattutto, per quei batteri (specie gram -) che impiegano la produzione e/o l’assorbimento di siderofori, rispettivamente, omologhi ed etero-loghi, come fonte primaria per l’acquisizione del ferro. A partire da tali aspetti, infatti, nel cam-po dell’igiene degli alimenti, è stata dimostrata l’attività inibente di alcune Pseudomonadaceae su altri batteri alteranti (8) e/o su alcuni agenti di alimentare (9). Alla luce di ciò, scopo del pre-sente lavoro è quello di valutare l’effetto di side-rofori eterologhi, prodotti da un ceppo di Pseu-domonas fluorescens, sul comportamento in vi-tro di Escherichia coli O157:H7. MATERIALI E METODI Per la presente sperimentazione è stato impie-gato un ceppo di Pseudomonas fluorescens pre-ventivamente identificato e saggiato per la pro-duzione di siderofori, in precedenti ricerche (9). L’estrazione dei siderofori avveniva a partire da colture del microrganismo in “brodo di pesce” (10), incubate a 32° C per circa 7- 10 giorni fino all’ottenimento di una colorazione giallo verda-stra. Successivamente la brodocoltura veniva centrifugata a 5000 rpm x g per 30 minuti a 4° C (6), procedendo alla raccolta del surnatante. Il surnatante veniva quindi acidificato a pH 2 con HCl 0,1 N, al fine di modificare la solubilità dei siderofori deprivandoli, nel contempo, del ferro. Dette modificazioni erano evidenziate da un re-pentino viraggio di colore della brodocoltura che da giallo-verdastra diveniva incolore. Si procedeva quindi ad una estrazione liquido-liquido con 0,4 Volumi di Acetato di Etile per tre volte mediante imbuto separatore di volume adeguato. Si effettuava la raccolta di tutto l’Acetato di Etile in un pallone, precedentemen-te pesato con bilancia di precisione (0,1 mg), e portato a secco mediante rotavapor a 65° C, col-legato a pompa del vuoto (6). Il pallone, previo passaggio in essiccatore per eliminare tracce di solvente, veniva nuovamente pesato al fine di determinare la quantità di siderofori estratti che venivano sospesi in 3 ml di soluzione salina allo 0,9%. Gli estratti venivano saggiati per la presenza di siderofori mediante reattivo C.A.S. e osservazione con raggi U.V..  Il potenziale effetto inibente dei siderofori nei confronti di E. coli O157:H7 si valutava, preli-minarmente, mediante determinazione della Concentrazione Minima Inibente (M. I. C.) se-condo la metodica ISO/TC 76 standards, del “Clinical and Laboratory Standard Institute 2006”, impiegando concentrazioni di siderofori pari a 112,00 - 56,00 - 28,00 - 14,00 - 7,00 - 3,50 - 1,75 - 0,87 - 0,43 µg/ml. Successivamente si alle-stivano prove di crescita del suddetto microrga-nismo in assenza e in presenza di siderofori a concentrazione nota (7 e 21 mg/l), alle seguenti condizioni ambientali: T 12°C, pH 5 e 7, aw 0,997 e 0,980. Le sospensioni di E. coli O157:H7 ave-vano una concentrazione iniziale pari a Log 4,02 ufc/ml ad eccezione di due prove in cui si impie-gava una concentrazione pari a Log 0.43 ufc/ml. RISULTATI La valutazione degli estratti in Acetato di etile mediante reattivo C.A.S. e raggi UV consentiva di evidenziare la positività per i siderofori. La valutazione della MIC ha consentito di eviden-ziare attività inibente per il ceppo di E. coli O157:H7 fino alla concentrazione di 7 µg/ml. Per quanto riguarda, inoltre, le prove di cresci-ta, i risultati sono espressi nelle figure 1-4. In particolare, a pH 7 e aw 0.997 (Fig. 1), il ceppo posto in coltura con 7 µg/ml e 21 µg/ml di side-rofori mostrava una tendenza al decremento, senza significative differenze in funzione della concentrazione, a differenza test controllo (0 µg/ml) nel quale si evidenziava un normale comportamento di crescita. Stessi aspetti veni-vano registrati anche a pH 7 e aw 0.980 (Fig. 2). Nelle prove a pH 5, invece, non si registrava al-cuna differenza tra test controllo e test con si-derofori, sia a 7 che a 21 µg/ml. CONSIDERAZIONI E CONCLUSIONI I risultati ottenuti mostrano come i siderofori prodotti da Pseudomonas fluorescens abbiano un’elevata attività inibente nei confronti di E. coli O157:H7 anche a concentrazioni relativa-mente basse (7 µg/ml). Detta attività è proba-bilmente da imputare, in accordo a Miethke e Marahiel (2007) (2), al peculiare meccanismo di captazione del ferro da parte degli E. coli, basa-to, quasi esclusivamente, sull’impiego dei side-rofori omologhi o eterologhi. Nel nostro studio, l’impiego di siderofori eterologhi deprivati dal ferro, ha, evidentemente, determinato una con-dizione di captazione degli stessi, da parte del microrganismo saggiato, senza, però, che a ciò seguisse un reale assorbimento del ferro, con la conseguente inibizione dei meccanismi metabo-lici del batterio.  In riferimento alla mancata attività inibente a pH acidi, è possibile ipotizzare una modificazio-ne strutturale dei siderofori, tale da impedirne il riconoscimento da parte dei recettori di mem-brana batterici. Riteniamo in conclusione, che lo studio in ogget-to possa rappresentare un interessante punto di Italian Journal of Food Safety, Vol. 1 N. 4 Giugno 2012 59 partenza nell’ottica del potenziale impiego dei siderofori nell’industria alimentare quali inibi-tori di alcuni agenti di tossinfezione alimentare, integrando, nel contempo i risultati di altri stu-di inerenti l’attività inibente di diversi ceppi di Pseudomonas spp. su altri agenti alteranti e/o di tossinfezione alimentare (8, 9). BIBLIOGRAFIA   Meldrum A.J. (1999). Regulation of Pyover-1.dine Biosynthesis in Pseudomonas aeru-ginosa. Tesi: Queen's University Kingston, Ontario, Canada.   Miethke M., Marahiel M. (2007). Sidero-2.phore-Based Iron Acquisition and Pathogen Control. Microbiology and Molecular Biolo-gy Reviews. 22, 413–451.  Neilands J.B. (1995). Siderophores: Struc-3.ture and Function of Microbial Iron Transport Compounds. Journal Biological Chemestry. 270, 26723–26726.  Roosenberg J.M.I, Lin Y.M., Lu Y. e Miller 4.M.J. (2000). Studies and Syntheses of Si-derophores, Microbial Iron Chelators, and Analogs as Potential Drug Delivery Agents. Current Medicinal Chemistry 7, 159–197.  Faraldo-Gòmez J.D, Sansom M.S.P. (2003). 5.Acquisition of siderophores in Gram nega-tive bacteria. Molecular Cell Biology. 4, 105-116.  Visca V., Colorii G., Serino L., Versili D., 6.Orsi N., Chiancone E., (1992). Metal regula-tion of siderophore synthesis in Pseudomo-nas aeruginosa and functional effects of si-derophore-metal complexes. Applied and Environmental Microbiology, 58, 2886- 2893.  Miller M.J. (2008). Siderophores (microbial 7.iron chelators) and siderophore-drug conju-gates (new methods for microbially selective drug delivery). Tesi: University of Notre Dame, Paris.  Champomier-Verges M., Richard J. (1994). 8.Antibacterial activity amond Pseudomonas strainof meat origin. Letters in Applied Mi-crobiology 18, 18–20.   Giarratana F., Giuffrida A., Ziino G. (2009). 9.Studio sulla produzione di siderofori in bat-teri alteranti di origine ittica e loro effetto sul comportamento di Aeromonas hydrophi-la. Atti SISVet 51, 377-388  Gram L. (1996). The influence of substrate 10.on siderophore production by fish spoilage bacteria. Journal of Microbiological Method. 25, 199-205.   

EFFECT OF SIDEROPHORES AGAINST E. COLI O157:H7

Open Access Repository

https://www.pagepressjournals.org/index.php/ijfs/article/download/ijfs.2012.4.57/473

EFFECT OF SIDEROPHORES AGAINST E. COLI O157:H7

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Directory of Open Access Journals

Open Access Repository