A study to detect the presence of bovine major histocompatibility complex (Bo-MHC) in maduracattle has been carried out. Lymphocyte samples were collected from 25 cattle. The protein of lymphocytesamples was analysed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) andtransferred onto nitrocellulose membrane. Bo-MHC proteins on the membrane were detected by monoclonalantibodies (anti-Bo-MHC class I) and BAQ150A (anti-Bo-MHC class II). The proteins of 48 kDa and 11kDa were detected by MAb B5C which appeared to be the alpha and beta chain of Bo-MHC class I. MAbBAQ150A detected protein band of 26 KDa which was likely to be the beta chain of Bo-MHC class II. Bo-MHC class I dan class II were clearly detected in madura cattle by MAbs which provides a basis for furtherinvestigation on the role of the MHC in the susceptibility the animals to many diseases

Fedik Abdul Rantam

I Nengah Kerta Besung

Ni Ketut Suwiti

jurnal veteriner

Directory of Open Access Journals

147PENDAHULUANSapi madura  merupakan salah satu sapipotong Indonesia yang dipertahankankemurniannya. Ketentuan ini diatur dalamStaatsblad 1934 No 57 jo.stbl.1937 No. 115.  Saatini breed sapi lain dilarang masuk ke PulauMadura, tetapi sapi madura disebarkan  keberbagai daerah seperti Jawa Timur, Flores,Kalimantan, dan Sumatra, walau pun per-kembangannya tidak sebaik di Pulau Madura.Secara fenotif, sapi madura menyerupai sapibali, yakni bentuknya yang uniform, ukurantubuhnya sedang sampai kecil, bertulang danberotot yang bagus, terutama sapi jantan(karapan) dan mempunyai kaki yang cukup kuatuntuk bertahan terhadap kerja tarik yang berat.Sapi madura umumnya berwarna coklatmedium dan coklat merah.  Warna putih sepertipada kaki (white stocking) juga seringditemukan di daerah abdomen dan bagian pahadalam. Namun, white stocking yang ditemukanpada kaki sapi madura berwarna lebih mudaDeteksi  Protein Bovine Major Histocompatibility ComplexKlas I dan Klas II pada  Sapi Madura (DETECTION OF THE CLASS I AND CLASS II PROTEINS OF BOVINE MAJORHISTOCOMPATIBILITY COMPLEX IN MADURA CATTLE) Ni Ketut Suwiti1, Fedik Abdul Rantam2, I Nengah Kerta Besung31Laboratorium  Histologi , 3Laboratorium BakteriologiFakultas Kedokteran Hewan, Universitas UdayanaJl. PB. Sudirman, Denpasar, Bali,Telepon: (0361)  223791, 701808; E-mail: nksuwiti@yahoo.co.id 2Laboratorium Virologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas AirlanggaKampus C Unair, Jl. Mulyorejo, Surabaya 60115ABSTRACTA study to detect the presence of bovine major histocompatibility complex (Bo-MHC) in maduracattle has been  carried out. Lymphocyte samples were collected from 25 cattle. The protein of lymphocytesamples was analysed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) andtransferred onto nitrocellulose membrane. Bo-MHC proteins on the membrane were detected by monoclonalantibodies   (anti-Bo-MHC class I) and BAQ150A (anti-Bo-MHC class II). The proteins of 48 kDa and 11kDa were detected by MAb B5C which appeared to be the alpha and beta chain of  Bo-MHC class I. MAbBAQ150A detected protein band of 26 KDa which was likely to be the  beta chain of Bo-MHC class II. Bo-MHC class I dan class II  were clearly detected in madura cattle by MAbs which provides a basis for furtherinvestigation on the role of the MHC in the susceptibility the animals to many diseases.Key word: Bovine Major Histocompatibility Complex, madura cattle, monoclonal, antibodies.dan tidak sejelas yang ditemukan pada sapi bali(Huitema, 1986).Dilihat dari ketahanannya terhadappenyakit, khususnya penyakit jembrana, sapimadura relatif lebih tahan dibandingkan sapibali.  Perbedaan ketahanan ini kemungkinanberhubungan dengan perbedaan  imunogenetikantara kedua breed sapi tersebut. Adanyaperbedaan genetik antara breed sapi, membukapeluang pendalaman tentang kerentanangenetik, yakni kerentanan individu terhadappenyakit ditinjau dari faktor imunogenetik.Imunogenetik adalah suatu konsep genetik yangmengendalikan perbedaan reaktivitas responsimun dan kerentanan tubuh terhadap suatupenyakit (Judajana et al., 1999).  Kendali genetiktersebut akan menentukan perbedaanreaktivitas imun pada setiap individu dalamsuatu populasi dan faktor genetik tersebutberpengaruh terhadap ketahanan dankerentanan individu terhadap penyakit(Angyalosi et al., 2001).Salah satu faktor imunogenetik yangmenentukan ketahanan individu terhadapJurnal Veteriner September 2008 Vol. 9 No. 3 :  147-151ISSN : 1411 - 8327148penyakit adalah major histocompatibilitycomplex (MHC) yang pada sapi disebut bovinemajor histocompatibility complex (Bo-MHC)atau bovine lymphocyte antigen (BoLa).Berdasarkan distribusi di jaringan, fungsi danstruktur antigennya Bo-MHC dibedakanmenjadi 3 klas, yaitu klas I, klas II, dan klasIII. Ketiga klas MHC tersebut mempunyaiperanan yang berbeda (Abbas, 1991; Daniel,1997; Goldsby et al., 2000).  Bersama sel Tsitotoksik, MHC klas I berperan dalam proseskekebalan seluler. MHC klas II berperan pentingdalam respons imun seluler maupun humoral.Peranannya dalam sistem kekebalan selulerdiawali dari masuknya antigen ke dalam tubuhmelalui proses up take oleh makrofag.Sementara itu, dalam sistem kekebalanhumoral MHC klas II berperan dalampembentukan antibodi. MHC klas III berperandalam pembentukan komponen protein dansistem komplemen.MHC merupakan suatu glikoprotein yangterdiri atas  kumpulan gen penting (major), danmempunyai sifat polimorfisme tinggi, sehinggamenimbulkan variasi ekspresi serta variasibobot molekul protein yang berbeda.  SistemMHC berhubungan dengan ketahanan dankerentanan terhadap penyakit (Shirly et al.,1999).  Di Indonesia penelitian tentang sistemMHC belum banyak dilakukan terutama sistemMHC pada sapi madura. Oleh karena itu dalampenelitian ini akan  diungkapkan keberadaansistem MHC pada sapi madura.METODE PENELITIANIsolasi LimfositLimfosit diisolasi dari 25 sampel darah sapimadura di Desa Bangkalan, Pulau Madurasesuai dengan metode yang dijabarkan olehWareing (1996). Sampel darah dipusing  dengankecepatan 3000 rpm selama  15 menit. Denganmenggunakan pipet Pasteur, lapisan sel darahputih dipisahkan dan dimasukkan ke dalamtabung yang berisi RPMI.  Campuran tersebutdimasukkan ke dalam tabung yang berisi 5 mlficolhipaque kemudian dipusing (3000 rpm,selama 30 menit).  Lapisan yang terbentuk padaperbatasan (interface) dipindahkan ke dalamtabung yang berisi 7 ml phosphate bufferedsaline (PBS), dan kembali dipusing padakecepatan 1250 rpm selama 15 menit.Supernatan  dicuci dua kali dengan PBS, danlimfosit dipanen dengan cara membuangsupernatannya.Preparasi Sampel untuk ElektroforesisSebelum melakukan elektroforesis terlebihdahulu dilakukan freez-thawing terhadapsampel berupa limfosit sebanyak tiga kali.Selanjutnya ditambahkan dengan 500 ml lisisbuffer  (Komposisi: 250 mM NaCl + 50 mM Tris-HCl pH 8,0 + 0,01% NaN3 + 10 mM glycine)dan didiamkan pada –20oC, selama 30 menit.Campuran limfosit dan lisis bufer kemudiandipusing (5000 rpm, selama 15 menit).Supernatan yang terbentuk diambil sebanyak50 ml dimasukkan ke dalam tabung danditambahkan dengan 50 ml sample loadingbuffer (Komposisi: Aqudest + 0,5 M Tris-HCl pH6,8 + Glyserol + 10% SDS + 0,05% B Mercapto-ethanol + 0,05% Bromophenol), selanjutnyadipanaskan dalam air mendidih (100oC, selama5 menit). Sampel ini selanjutnya dipergunakanbahan untuk elektroforesis.Pemisahan dan isolasi protein dilakukandengan sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegel electrophoresis (SDS-PAGE) memakai alatProtean II Apparatus (Bio-Rad, USA).  Pita hasilelektroforesis yang terbentuk dan dicurigaisebagai protein Bo-MHC diisolasi, dengan caradipotong menggunakan skalpel steril dandihancurkan, kemudian dimasukkan ke dalamdialisis bag untuk proses elektroelusi, denganmenggunakan alat electro-eluter (Bio-Rad).Protein hasil elektroelusi ini dipergunakansebagai sampel untuk menentukan bobotmolekul protein Bo-MHC klas I dan klas II sapimadura.Deteksi Protein Bo-MHCKeberadaan protein Bo-MHC dilacak denganWestern blotting (WB). Protein hasil elektroelusidielektroforesis dalam gel polyacrilamidmenggunakan 12,5% separating gel dan 4%loading gel. Selanjutnya protein di dalam gelditransfer ke membran nitroselulosa, danmembran diblok dengan bovine serum albumin(BSA) 1% dalam PBS. Protein Bo-MHC dilacakdengan antibodi monoklonal B5C untuk Bo-MHCklas I, dan BAQ150A untuk Bo-MHC klas II(VMRD, Pullman, USA), goat antimouse IgG-biotin (VMRD, Pullman, USA), avidin-horseradish peroxidase (avidin-HRP) (Bio-Rad,USA), dan substrat diazino-benzidine (DAB,Sigma chemical Co. USA).Suwiti et al  Jurnal Veteriner149HASIL DAN PEMBAHASANEkspresi Protein Bo-MHC Klas IHasil elektroforesis protein limfosit asal 25ekor sapi madura menunjukkan bahwa berbagaipita muncul pada gel.  Namun, belum diketahuiprotein yang mana yang termasuk Bo-MHC(data tidak diperlihatkan). Uji WB denganantibodi monoklonal B5C (anti-Bo-MHC klas I)menunjukkan reaksi positif, yang ditandaidengan pemunculan 2 pita pada kertasnitroselulosa. Pita protein yang terlacakmempunyai bobot molekul  sekitar 48 kDa dan11 kDa. Protein dengan 48 kDa dan 11 KDasecara berturut-turut tampaknya merupakanprotein Bo-MHC klas I rantai alfa dan  sebagairantai beta (Gambar 1).MHC klas I disusun oleh glikoprotein yangterdiri atas rantai berat alfa (45 kDa) dan rantaibeta-2-mikroglobulin (12 kDa) yang keduanyaberikatan secara non-kovalen (Jonathan et al.,1994). Rantai alfa dibagi dalam tiga bagian, yaitubagian ekstraseluler, bagian transmembran danbagian intraseluler.  Bagian ekstraselulermembawakan ciri antigen, sedangkan bagianintreseluler adalah bagian yang meneruskansinyal dari luar ke dalam sel.  Rantai  alfa-1dan alfa-2 membentuk suatu celah yang sangatpolimorfik dan merupakan tempat menempelnyaantigen. Sifat polimorfik ini memungkinkanberbagai macam  peptida untuk dapat terikatpada celah ini. Sifat polimorfik dan variasinyayang besar ini merupakan bagian yangmenentukan spesifisitas di antara alel.Sedangkan bagian transmembran bersifathidrofobik (Bellanti, 1993).Rantai ringan beta merupakan bagian yangkonstan dan mempunyai sekuen yang homologdengan sekuen imunoglobulin (bagian konstan)dan berfungsi untuk mempertahankan bentukdan struktur dari molekul sehingga bagian inimerupakan bagian yang homolog di antara alel.Rantai ringan pada kedua ujungnya diakhiridengan NH2 dan COOH.   Selanjutnya Jonathanet al. (1994) mengatakan bahwa pemunculanMHC klas I berhubungan dengan respons imundan berperan dalam penolakan dalampencangkokan jaringan.Ekspresi Bo-MHC Klas IIHasil pengujian dengan antibodimonoklonal  BAQ150A  menunjukkan bahwa Bo-MHC klas II terlacak dengan bobot molekulsekitar 26 kDa (Gambar 2). Pita protein tersebutJurnal Veteriner September 2008 Vol. 9 No. 3 :  147-151Gambar 1. Hasil pengujian Bo-MHC klas Isapi madura dengan antibodimonoklonal B5C. (1) Marker, (2)Reaksi positif, protein Bo-MHCdengan AbMo, (3) Reaksi negatif,protein Bo-MHC tanpa AbMo, (4)Reaksi negatif, AbMo tanpa proteinBo-MHC sapi madura.Gambar 2. Hasil pengujian Bo-MHC klas II sapimadura dengan AbMo BAQ150Apada pemeriksaan WB. (1) Marker,(2) Reaksi positif, protein Bo-MHCdengan AbMo, (3) Reaksi negatif,protein Bo-MHC tanpa AbMo, (4)Reaksi negatif, AbMo tanpa proteinBo-MHC sapi madura.150Suwiti et al  Jurnal Veterinertampaknya protein Bo-MHC klas II rantai beta.Bo-MHC klas II merupakan suatu glikoproteindan mengandung dua ikatan non-kovalen daridua rantai polipeptida. Rantai polipeptidatersebut adalah rantai alfa dengan bobot molekul31-34 kDa, dan rantai beta dengan bobot molekul26-29 kDa (Bernadette et al., 1993; Margaret etal., 1997).Menurut Ababou et al. (1994), denganteknik imunopresipitasi, Bo-MHC klas IIdengan 33 kDa yang diketahui sebagai rantaialfa, dan 29 kDa sebagai rantai beta. Bobotmolekul protein Bo-MHC klas II yang diisolasidari leukosit darah terdiri atas  rantai alfa (32-34 kDa) dan rantai beta (26-29 kDa).  Koufmanet al. (1994) menyatakan bahwa MHC klas IIrantai alfa mempunyai bobot molekul protein33-35 kDa dan rantai beta 26-29 kDa. Variasibobot molekul juga ditemukan oleh Jonathan etal. (1993), yakni mencapai 45 kDa.Bobot molekul protein Bo-MHC sapi maduraini sesuai dengan yang dilaporkan oleh Ababouet al. (1994), walau pun sumber limfosit yangdiambil dari biakan sel BL3 yang telah diinfeksidengan Bovine Lymphosarcoma Virus (BLV).Bobot molekul protein Bo-MHC diperoleh 44 kDa,33 KDa, dan 29 kDa, sedangkan menurut Abbas(1991) bobot molekul protein MHC rantai alfapada mencit mencapai 47 kDa sedangkan  rantaibeta 12 KDa dan  pada manusia 44 kDa.Bobot molekul protein Bo-MHC tampaksangat bervariasi karena sifat polimorfismenyayang sangat tinggi sehingga bobot molekulnyasangat bervariasi pada setiap individu. Disamping itu, Bo-MHC juga berhubungan dengankerentanan hewan terhadap suatu penyakit.Oleh karena itu, banyak peneliti yang berusahamengungkapkan peranannya dalam responsimun  (Davenport dan Hill, 1996).  Pada sapimadura, Bo-MHC klas II rantai alfa tampaktidak terlacak dengan  antibodi monoklonalBAQ150A. Hal ini mungkin disebabkan olehspesifisitas antibodi monoklonal yang hanyamengenali rantai beta (Bernadette et al., 1993).Di samping itu, ada beberapa sifat khas proteinBo-MHC yang  dapat menyebabkan reaksi silangparsial antar molekul (Ababau et al., 1994).Reaksi silang parsial semacam itu menyebabkantidak semua antibodi monoklonal dapat  bereaksisecara sempurna dengan antigen protein Bo-MHC.SIMPULANBobot molekul protein Bovine MajorHistocompatibility Complex sapi madura klas Irantai alfa: 48 kDa dan rantai beta: 11 kDa,sedangkan protein Bo-MHC klas II mempunyaibobot molekul 26 kDa teridentifikasi sebagairantai beta.  Studi ini diharapkan dapatdipergunakan sebagai dasar menentukanperanan protein dalam kerentanan sapi maduraterhadap penyakit.UCAPAN TERIMA KASIHUcapan terima kasih disampaikan kepadaProf. Dr. PG Konthen, dr. SpPD, Prof. drh. IGBAmitaba, dan Dr. Irwan Setiabudi, SpPK,  atasbimbingannya dan Bapak Kepala TDC UnairSurabaya, serta Bapak Kepala BBV Denpasaratas diizinkannya mempergunakan sarana danprasarana selama  penelitian berlangsung.DAFTAR PUSTAKAAbabou J, Goyeneche WC, Davis D, Levy. 1994.Evidence for the expression of three differentBoLA-class II molecules on the bovine BL-3cell line: determination of a non-DR non DQgene product.  J Leuk Biol 56:182-186Abbas AK, Litchman AH, Pober JS. 1991.Celluler an Molecular Immunology.Sounders Company. Pp. 19-347Angyalosi G, Neveb R, Wolowczuk I, DelanoyeA, Herno J, Auriault C. 2001.  HLA class IIpolymorphism influences onset and severityof pathology in Schistosoma mansoni-infected transgenic mice.  Infect Immun  69:5874Bellanti JA.1993.  Imunologi III.  Cetakanpertama. Yogyakarta: Universitas GadjahMada Press.  Hal. 58-304Bernadette C, Taylor K, Yeon C, Robert JS, PeterFM, Jefrey LS. 1993.  DifferentialExpression of Bovine MHC Class II AntigenIdentified by Monoclonal Antibodies.  J LeucBiol  53:479-489Daniel P, Stites AI, Tritram G,  Parslow. 1997.Medical Immunology. 9th ed.   Apleton andLargw. The United Sates of America: ASimon and Schuster Company.  Pp.85-181151Davenport MP, Hill AVS. 1996.  Peptidesassociated with MHC class I & II moleculesIn Browning and Michael AJ (Eds.) HLAand MHC genes molecules and function.Oxford: Bios Sc Publ Ltd. Pp.277- 308Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne BA. 2000.Overview of the Immune System In KubyImmunology. 4th ed.  New York: WHFreeman and Company.  Pp.3-26Huitema H. 1986.  Peternakan di daerah tropik,arti ekonomi dan kemampuannya.Penelitian di beberapa daerah Indonesia.Jakarta: Penerbit PT Gramedia. Hal. 25-30Jonathan M,  Austyn, Kathryn, Woood J. 1994.The Major Histocompatibility Complex. InBrowning, Michael AJ (Ed) Principles ofCellular and Molecular Immunology.  NewYork: Oxford University Press Inc. Pp.65-112Judajana FM. 1999.  Imunogenetika.  In  PitonoS, Judajana FM, Suhartono TP, Subijanto(Ed) Imunologi Mukosal Kedokteran.Surabaya: Airlangga University Press. Hal.1-25Kreisel D, Krupnick AS, Szeto WY, Popma SH,Sankaran D, Krasinskas AM, Amin KM,Rosengard BR. 2001.  A simple method forculturing mouse vascular endothelium. JImmunol Methods 254: 31-45Jurnal Veteriner September 2008 Vol. 9 No. 3 : 147-151Margaret GP, Cogggeshall KM, Leslie SJ, PatJL. 1997.  Bovine Luteal Cells Elicit MajorHistocompatibility Complex Class IIDependent T-Cell Prolifration.  J Biol Repro57: 887-893Maudsley DJ, Pound JD. 1991.  Modulation ofMHC antigen expression by viruses andoncogenes. Immunol Today 12:429-431Scherazade SN, Germain RN.   1992.  How MHCclass II Molecules Work: Peptide-DependentCompletion off Protein Folding.  J ImmunolToday 13: 43-46Shirley A, Keith E, Ballingall T. 1999. CattleMHC: evolution in action.  ImmunolReviews  167: 159-168Stone RT, Muggli C.  1993.  BoLA-DIB SpeciesDistribution, Linkage with DOB andNorthern Analysis.  J Anim Gen  24: 41-43Wareing S. 1996. Development of Assays toMonitor The Cell-Mediated ImmuneResponse to Recombinant Jembrana DiseaseVirus (JDV) Protein in Cattle. WesternAustralia: School of Veterinary Science,Murdoch University

Deteksi Protein Bovine Major Histocompatibility Complex Klas I dan Klas II pada Sapi Madura

https://ojs.unud.ac.id/index.php/jvet/article/download/3328/2372

Deteksi Protein Bovine Major Histocompatibility Complex Klas I dan Klas II pada Sapi Madura

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Directory of Open Access Journals