Plass, Jacqueline Regina Maria

Dutch

During the past decade, important progress has been made in our understanding of the pathophysiology of cholestasis. Inherited disorders have been explained at the molecular level and were shown to be the result of mutations in enzymes involved in bile salt biosynthesis or transmembrane transporters involved in bile formation. Acquired cholestasis, for instance due to inflammation, is linked to disregulation of these proteins. The challenge of future research is to use this knowledge to develop successful therapies for cholestatic patients. The studies described in this thesis initiate such studies. We showed that a mutation in BSEP may cause PFIC-2 even though the protein product is a normally active bile salt export pump. The cause of the disease is due to a specific mutation in the BSEP gene that strongly reduces the BSEP protein level, most likely due to increased protein degradation. This phenomenon has also been described for several other inherited diseases. An important focus of esearch is therefore to define conditions or drug therapies that will maintain or increase the protein level of the mutant, but active protein in these patients. Novel targets to treat cholestasis are the transcription factors that regulate the levels of enzymes and transporters involved in the synthesis and enterohepatic circulation of bile salts. RXR and FXR are key players in this process. Endogenous and synthetic ligands for these transcription factors have been identified. Recent research, however, shows that the activation of FXR-target genes is ligand-dependent. In other words, a specific target gene may be activated by the endogenous ligand, CDCA, but not by the synthetic ligand GW4064. In addition, our own research shows that the ligand for RXR, 9-cis retinoic acid, in combination with bile salt-activated FXR, may simultaneously stimulate and inhibit expression of a subset of FXR-target genes. Therapies to treat cholestatic disease aimed at modulating the activity of these transcription factors therefore requires an in depth study of the effect of the (combination of the) individual ligands on human gene transcription. In the meantime, it should be noted that in a significant number of PFIC patients the genetic defect still has not been elucidated. Therefore, novel genes/proteins that are essential for bile salt homeostasis may be identified in the near future. Altogether, many challenges await us still to further understand the (molecular) causes of cholestasis and to develop successful therapies for this disease

Dissertations of the University of Groningen

   University of GroningenFunction and regulation of the human bile salt export pumpPlass, Jacqueline Regina MariaIMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of recordPublication date:2005Link to publication in University of Groningen/UMCG research databaseCitation for published version (APA):Plass, J. R. M. (2005). Function and regulation of the human bile salt export pump. s.n.CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).The publication may also be distributed here under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license.More information can be found on the University of Groningen website: https://www.rug.nl/library/open-access/self-archiving-pure/taverne-amendment.Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.Download date: 11-10-2022   111        Samenvatting    112       Achtergrond Op de huid na is de lever het grootste orgaan van ons lichaam. De menselijke lever is ongeveer 1,5 kilo zwaar. Het is eigenlijk de chemische fabriek van ons lichaam. De functies van de lever zijn dan ook heel divers, maar kunnen grofweg in drieën worden opgesplitst: de vorming van gal, dat nodig is voor de spijsvertering, het onschadelijk maken en uitscheiden van lichaamseigen afvalstoffen en lichaamsvreemde stoffen (bijvoorbeeld medicijnen en giftige stoffen) en de stofwisseling van koolhydraten, vetten, eiwitten en hormonen. De cellen die deze functies uitoefenen zijn de hepatocyten. De lever bestaat voor het grootste deel uit deze cellen. Hepatocyten werken als een soort filter. Ze nemen allerlei stoffen op uit het bloed, en scheiden andere stoffen uit. Deze stoffen gaan òf (terug) naar het bloed òf naar de gal. Dit kan meestal niet zomaar, omdat elke lichaamscel door een zogenaamd celmembraan wordt omgeven. De celmembraan vormt een barrière voor veel stoffen. Om toch deze stoffen te kunnen opnemen en uitscheiden, maakt de hepatocyt gebruik van eiwitten die in de celmembraan zitten en die deze stoffen over de membraan kunnen transporteren: de transporteiwitten. Een hepatocyt grenst zowel aan een bloedvaatje, de zogenaamde sinusoïde, als aan een galkanaaltje, dat de gal afvoert naar de galblaas. Het gedeelte van de celmembraan dat grenst aan het bloed wordt de sinusoïdale membraan genoemd, en het gedeelte van de celmembraan dat aan het gal grenst, wordt de canaliculaire membraan genoemd. Via de sinusoïdale membraan worden stoffen opgenomen uit het bloed, maar ook afgegeven aan het bloed. Via de canaliculaire membraan worden stoffen uitgescheiden naar de gal. Elk transporteiwit is gespecialiseerd in het transporteren van bepaalde stoffen en zit in één van de membranen. Als deze transportprocessen niet goed functioneren, kan dit resulteren in (lever)ziekte. Hierbij ontstaat vaak een stapeling van bepaalde stoffen in het bloed en de lever die niet goed naar de gal getransporteerd worden. Een bekend voorbeeld hiervan is geelzucht, waarbij het transport van bilirubine naar de gal is verstoord. Door de hoge concentraties bilirubine in het bloed ontstaat de gele (huids)kleur. Dit is echter een relatief onschuldige conditie omdat bilirubine zelf geen toxische effecten heeft. Andere galcomponenten, zoals galzouten of fosfolipiden, zijn wel zeer schadelijk als deze niet goed naar de gal worden uitgescheiden. In dit proefschrift is vooral het belang en de regulatie van galzouttransport naar de gal geanalyseerd. Hoofdstuk 1 beschrijft de huidige stand van zaken wat betreft de kennis over transporteiwitten van de hepatocyt die betrokken zijn bij galvorming. Speciale aandacht wordt gegeven aan de eiwitten die galzouten transporteren en de mechanismen die de hoeveelheid en activiteit van deze eiwitten bepalen. Eén van deze eiwitten wordt uitgebreider bestudeerd in de volgende drie hoofdstukken: de Bile Salt Export Pump, afgekort BSEP. Deze galzoutexportpomp komt alleen in de lever voor en zit in de canaliculaire membraan. Daar is dit eiwit verantwoordelijk voor het transport van galzouten uit de hepatocyt naar de gal. Gal bestaat voor het grootste deel uit water en voor het overige uit opgeloste stoffen, waaronder de galzouten. Galzouten spelen een belangrijke rol bij de vertering van vettige voedingsstoffen. Ze functioneren als een soort zeep: ze zorgen er namelijk Samenvatting   113       voor dat deze stoffen in de darmen in oplossing blijven, zodat ze beter opgenomen kunnen worden door de darmcellen. Hiermee zijn ze essentieel voor de uitscheiding van "giftige" verbindingen. Tegelijkertijd zijn ze ook belangrijk voor de opname van vetachtige voedingsstoffen in de darm, zoals vitaminen (A, D, E en K). De lever is de enige plaats in het lichaam waar galzouten gemaakt worden. Dit is een ingewikkeld proces waarbij cholesterol wordt omgezet in galzouten. Vervolgens worden ze in een galkanaaltje uitgescheiden en komen ze uiteindelijk terecht in hun opslagplaats, de galblaas. Wanneer galzouten nodig zijn voor de vertering van vettige voedingsstoffen worden ze met de gal uitgescheiden in de darm. Ons lichaam gaat heel zuinig om met de galzouten. Het merendeel wordt dan ook weer opgenomen door de darmcellen en worden via het bloed weer teruggevoerd naar de lever. De hepatocyten nemen de galzouten uit het bloed op om ze weer te kunnen uitscheiden in het galkanaaltje. De route die de galzouten afleggen tussen darmen en lever wordt de enterohepatische kringloop van galzouten genoemd (entero = darmen; hepatisch = lever). Deze kringloop wordt in stand gehouden door transporteiwitten in de darm en in de lever, waaronder BSEP. Wanneer deze kringloop wordt verstoord, bijvoorbeeld door een defect in BSEP, is er sprake van cholestase. De D482G-mutatie leidt tot een functioneel maar instabiel BSEP-eiwit Kinderen met de erfelijke leverziekte "Progressive Familial Intrahepatic Cholestasis" type 2 (PFIC2) hebben vanaf hun geboorte cholestase, die vervolgens alleen maar erger wordt.. Bij PFIC2 kunnen er geen galzouten van de hepatocyt naar het galkanaaltje getransporteerd worden, omdat door fouten of mutaties in het gen van BSEP er geen (goed) eiwit gemaakt kan worden. Het gevolg is dat galzouten zich ophopen in de levercellen en in het bloed. Een belangrijk symptoom van cholestase is jeuk. Bij deze erfelijke vorm van cholestase uit dit zich echter ook in groeiachterstand van deze patiëntjes, omdat voedingsstoffen niet goed opgenomen kunnen worden door het tekort aan galzouten in de gal. Bovendien raakt hun lever door de giftige werking van de overmaat aan galzouten in de levercellen zodanig beschadigd dat de lever getransplanteerd moet worden. Er zijn verschillende mutaties van het BSEP-gen bekend en in hoofdstuk 2 onderzoeken we één van die mutaties: de D482G-mutatie. Deze code betekent dat van de 1321 aminozuren waar het BSEP-eiwit uit bestaat er 1 anders is dan normaal. Op positie 482 is een glycine (G) aanwezig in plaats van het normale aspartaat (D). We hebben in de eerste plaats gekeken of een BSEP-eiwit met deze mutatie nog wel galzouten kan transporteren. Dat was het geval, dus dit kan niet de reden zijn waarom deze patiëntjes cholestase krijgen. Vervolgens bestudeerden we de vorming van het eiwit zelf. Door de D482G-mutatie bleek er veel minder BSEP-eiwit gevormd te worden en dit beetje komt ook nog niet eens allemaal op de goede plek (canaliculaire membraan) terecht. In het laboratorium hebben we kunnen vaststellen dat bij een lage temperatuur het D482G-BSEP-eiwit wel goed gevormd wordt. Dit alles betekent dat de D482G-mutatie niet leidt tot functieverlies van BSEP, want het eiwit kan nog wel galzouten transporteren. Echter, door deze ene mutatie wordt er te weinig van dit transporteiwit aangemaakt en dat is dus onvoldoende om    114       galzouten efficiënt naar de gal te transporteren. Waarschijnlijk wordt het eiwit herkend als “fout” en daardoor snel afgebroken. Deze studie heeft aangetoond dat het mutante eiwit wel zijn normale functie kan uitvoeren. In de toekomst zou het dus mogelijk kunnen zijn dat er therapieën worden ontwikkeld die gericht zijn om de versnelde afbraak van het mutante eiwit tegen te gaan. Dit is niet geheel ondenkbaar, aangezien ditzelfde mechanisme is beschreven voor verschillende andere erfelijke aandoeningen, onder andere bij taaislijmziekte. Het is wellicht mogelijk om deze verschillende aandoeningen met eenzelfde medicijn/therapie te behandelen. Galzouten reguleren de expressie van BSEP met behulp van FXR Tot voor kort werden galzouten alleen gezien als “oplosmiddel” voor vetachtige verbindingen die daarmee efficiënt uitgescheiden of juist opgenomen kunnen worden. Echter, in de afgelopen jaren is gebleken dat galzouten ook zeer belangrijke signaalmoleculen zijn. Zo reguleren ze zelf dat de enterohepatische kringloop in stand gehouden wordt door voortdurend de synthese van galzouten en het transport ervan in lever en darm op elkaar af te stemmen. De synthese wordt verhoogd als de concentraties van galzouten in de lever laag zijn. Transport van galzouten naar de gal wordt verhoogd als de concentraties ervan in de lever verhoogd zijn. Het moleculaire mechanisme van deze regulatie blijkt voornamelijk te liggen in het aansturen van gentranscriptie. Galzouten zijn liganden van de transcriptiefactor Farnesoid X receptor of FXR. FXR dat geactiveerd is door galzouten reguleert de transcriptie van genen die coderen voor eiwitten die galzouten transporteren en enzymen die betrokken zijn bij de synthese van galzouten. In hoofdstuk 3 wordt aangetoond dat galzouten ook de expressie van humaan BSEP reguleren. Deze activeren FXR, die samen met de transcriptiefactor Retinoic X Receptor of RXR de transcriptie van BSEP verhoogt. FXR en RXR binden als zogenaamde heterodimeer samen aan een specifieke DNA-sequentie, de FXRE, in de promoter van het BSEP-gen. De door galzouten gestimuleerde expressie van BSEP wordt tenietgedaan als de FXRE in de BSEP promoter is gemuteerd. Als met behulp van de techniek van RNA-interferentie de hoeveelheid FXR wordt verlaagd, is eveneens de galzout-geïnduceerde expressie van BSEP afwezig. Deze resultaten laten zien dat ook bij de mens, de galzoutexportpomp BSEP wordt gereguleerd door activering van FXR door galzouten. Vitamine A is belangrijk voor de expressie van BSEP Als vervolg op hoofdstuk 3 hebben we in hoofdstuk 4 bepaald of 9-cis retinolzuur (9cRA), dat een ligand is van RXR, ook een rol speelt bij de regulatie van de transcriptie van het BSEP-gen. 9cRA wordt gevormd uit vitamine A. Vitamine A is een vetachtige vitamine en galzouten zijn belangrijk voor de opname ervan in de darm. Vitamine A is belangrijk voor verschillende processen in ons lichaam, bijvoorbeeld het gezichtsvermogen. Een bekend gevolg van tekort aan vitamine A is nachtblindheid. Deze vitamine is ook belangrijk voor de groei en ontwikkeling van het Samenvatting   115       embryo en de voortplanting. Van verschillende genen die door FXR en RXR gereguleerd worden is bekend dat de aanwezigheid van beide liganden, galzouten en 9cRA, zorgt voor de sterkste expressie. Wij hebben ontdekt dat dit niet het geval is voor BSEP. Sterker nog: 9cRA lijkt juist een remmende werking te hebben. Dus wanneer beide transcriptiefactoren én beide liganden aanwezig zijn wordt er minder BSEP gemaakt dan met alleen galzouten en beide transcriptiefactoren. We hebben dit aangetoond zowel in in vitro experimenten, met humane cellijnen, als in in vivo experimenten met muizen. De muizen kregen 12 weken voer waarin geen vitamine A zat. Vervolgens kregen ze 1 week lang ook nog galzouten toegevoegd aan hun voer. In totaal werden 4 groepen muizen vergeleken: muizen met een tekort aan vitamine A (VAD-muizen) die 1 week wel of geen galzouten in het voer kregen en controlemuizen (géén tekort aan vitamine A) die eveneens 1 week wel of geen galzouten in het voer kregen. Zoals verwacht werd in de levers van de VAD-muizen met galzouten in de voeding de hoogste BSEP-expressie waargenomen. Deze resultaten laten zien dat vitamine A een belangrijke factor is in de regulatie van galzouthomeostase. Patiënten met cholestase hebben vaak ook een laag vitamine A-gehalte. De cholestase kan een gevolg zijn van een te lage BSEP-expressie. Het behandelen van deze patiënten met vitamine A-houdende preparaten kan echter de expressie van BSEP nog verder verlagen en daarmee de cholestase verergeren. FXR beïnvloedt ook de expressie van niet-galzoutgerelateerde genen Van verschillende eiwitten is al bekend dat hun expressie gereguleerd wordt door galzouten en FXR (samen met RXR en 9cRA). Toch komen er nog steeds nieuwe bij. In hoofdstuk 5 passen we een nieuwe techniek toe, de microarray-technologie, op zoek naar eiwitten die ook door galzouten en FXR gereguleerd worden. De microarray-technologie maakt gebruik van een chip waarop alle genen van alle eiwitten van, bijvoorbeeld, de mens zitten. Met deze technologie kun je bestuderen wat er met de expressie van alle genen gebeurt, wanneer er bijvoorbeeld meer galzouten en FXR aanwezig zijn. Dit hebben we dan ook gedaan en we hebben ontdekt dat mogelijk Fibrinogeen Bβ (FGB) door galzouten en FXR wordt gereguleerd. In tegenstelling tot de meeste andere FXR-targetgenen lijkt dit eiwit geen rol te spelen in de galzouthuishouding. FGB vormt samen met Fibrinogeen Aα (FGA) en Fibrinogeen γ (FGG) het eiwit Fibrinogeen. De expressie van de FGA en FGG wordt, zij het in minder mate dan FGB, ook verhoogd door galzouten en FXR. Fibrinogeen wordt in de lever gemaakt en is belangrijk voor de bloedstolling. Het is mogelijk dat Fibrinogeen een rol speelt bij littekenvorming (fibrose) in de lever. Fibrose is een reactie van de lever op weefselschade, bijvoorbeeld door de giftige effecten van een overmaat aan galzouten in de lever bij cholestase. De effecten van galzouten en FXR op de expressie van deze drie eiwitten moeten echter nog nader bestudeerd worden om vast te kunnen stellen dat hun expressie ook werkelijk door galzouten en FXR beïnvloed wordt.    116       Conclusies en perspectieven De afgelopen jaren is onze kennis van de cellulaire processen die cholestase veroorzaken sterk toegenomen. Erfelijke aandoeningen die resulteren in chronische cholestase zijn tot op moleculair niveau uitgezocht: ze zijn het resultaat van mutaties in eiwitten die een rol spelen in de galzouthuishouding, zoals enzymen in de lever die galzouten maken en eiwitten in lever- en darmcellen die galzouten de cel in of uit transporteren. Cholestase kan ook vele andere, niet-genetische, oorzaken hebben, bijvoorbeeld een ontsteking in de lever. Het blijkt dat dan de hoeveelheid galzoutvormende enzymen en/of de galzouttransporters niet goed is gereguleerd. De wetenschappelijke uitdaging is nu om deze kennis te gebruiken voor de ontwikkeling van nieuwe behandelmethoden voor patiënten met cholestase. Het werk beschreven in dit proefschrift geeft hiervoor een eerste aanzet. We hebben laten zien dat sommige PFIC2-patiënten een mutatie in het BSEP-gen hebben die de functie van deze transporter niet aantast. Toch hebben deze patiënten cholestase. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt doordat het mutante BSEP-eiwit in de levercel herkend wordt als "fout" en versneld wordt afgebroken. Hierdoor kan er niet voldoende galzouttransport naar de gal plaatsvinden en ontstaat er cholestase. Verschillende andere erfelijke ziekten (bijvoorbeeld taaislijmziekte) blijken een vergelijkbare oorzaak te hebben; er is te weinig van het mutante, maar wel functionele, eiwit. Een belangrijk speerpunt van toekomstig onderzoek is dan ook om behandelmethoden te ontwikkelen die de hoeveelheid van het mutante eiwit naar een voldoende niveau brengen. Sinds een aantal jaren is er ook een volledig nieuwe groep van eiwitten geïdentificeerd waarop behandeling van cholestase gericht kan zijn. Dit zijn de transcriptiefactoren die de hoeveelheid galzoutproducerende enzymen en galzouttransporters reguleren. FXR en RXR zijn hiervoor de belangrijkste "targets". Verschillende natuurlijke en synthetische liganden die deze transcriptiefactoren activeren zijn al voorhanden. Uit recent onderzoek blijkt echter dat het effect van FXR op de regulatie van eiwitten afhankelijk is van het gebruikte ligand. Met andere woorden, het natuurlijke ligand van FXR, het galzout CDCA, leidt tot een verhoging van de expressie van een bepaald FXR-"target"eiwit, terwijl dit niet gebeurt met het synthetische ligand GW4064. Bovendien laten wij in dit proefschrift zien dat het ligand van RXR, het vitamine A-derivaat 9-cis retinolzuur, in combinatie met FXR en galzouten op hetzelfde moment de expressie van een aantal FXR-"target"-genen verhoogt terwijl dat van andere FXR-"target"-genen wordt verlaagd. Het is daarom van belang om de effecten van de verschillende (en ook combinaties van) liganden grondig te onderzoeken alvorens men een behandeling kan starten die is gebaseerd op de manipulatie van deze transcriptiefactoren. Ondertussen moeten we ons ook realiseren dat er nog steeds een groep patiënten met PFIC is waarvan we de genetische oorzaak niet weten. Dit betekent dat er nog steeds nieuwe genen/eiwitten ontdekt zullen worden die een rol spelen in de galzouthuishouding. Ook deze nieuwe factoren kunnen van groot belang zijn bij het ontstaan van cholestase als gevolg van niet-genetische componenten zoals ontsteking, medicijnen, alcohol, drugs, enzovoort. Daarom is het belangrijk om naar deze onbekende genen/eiwitten te blijven zoeken. Samenvatting   117       Concluderend kan gesteld worden dat er nu verschillende eiwitten bekend zijn waarop nieuwe behandelmethoden voor patiënten met cholestase gericht kunnen zijn. De toekomst moet uitwijzen of hiermee efficiënte en veilige therapieën ontwikkeld kunnen worden. Met andere woorden, er is nog genoeg onderzoek te doen om meer inzicht te krijgen in de (moleculaire) oorzaken van en behandelmethoden voor cholestase.   118       

Function and regulation of the human bile salt export pump

https://pure.rug.nl/ws/files/2915100/samenvat.pdf

Function and regulation of the human bile salt export pump

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Dissertations of the University of Groningen