Os autores examinaram retrospectivamente 3 7 neoplasias malignas indiferenciadas (NMI) através da técnica de imunoperoxidase, com um painel mínimo de anticorpos; antígeno comum leucocitário (LCA), proteína S100 e citoqueratina de baixo peso molecular (AE1). Apesar do material examinado não ter seguido previamente processamento técnico ideal, a sensibilidade obtida, de 57%, e a especificidade, de 100%, são plenamente satisfatórias.The authors made a retrospective study of 37 malignant undifferentiated neoplasms by immunoperoxidase method, employing a small antibody panel: leucocyte common antigens (LCAs), S100 protein, Keratin (AE1). Although the previous technical processing had been inadequate the sensitivity of 57% and specificity of 100% were considered completely satisfactory

Bolzzoni, Adelir

Cerski, Carlos Thadeu Schmidt

Oliveira, Fernando Rocha de

Prolla, Patrícia Ashton

Portuguese

Lume 5.8

Artigos Originais lmunoperoxidase no Diagnóstico de Neoplasias lndiferenciadas SINOPSE Os autores examinaram retrospectivamente 3 7 neoplasias malignas indiferenciadas (NMI) através da técnica de imunoperoxidase, com um painel mínimo de anticorpos; antígeno comum leucocitário (LCA), proteína S100 e citoqueratina de baixo peso molecu-lar (AE1). Apesar do material examinado não ter se-guido previamente processamento técnico ideal, a sen-sibilidade obtida, de 57%, e a especificidade, de 100%, são plenamente satisfatórias. UNITERMOS: Jmunoperoxidase, Anticorpos, Neop/asias malignas indiferenciadas, Diagnóstico INTRODUÇÃO A terapêutica quimioterápica de neoplasias evo-luiu muito nos últimos anos e, embora bons resulta-dos possam ser alcançados, ela é uma terapêutica es-pecífica e de eficácia variável, de acordo com as dife-rentes origens tumorais. A especificidade do tratamen-to torna inaceitável, na prática, um diagnóstico ana-tc;>mopatológico tão inespecífico como o de neoplasia maligna indiferenciada (NMI). Felizmente, as possibilidades diagnósticas através da imuno-histoquímica também aumentaram muito nos últimos anos. Destas técnicas, a imunoperoxida-Trabalho realizado no Serviço de Patologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, UFRGS. * Professor-Adjunto do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da UFRGS. * * Doutorandos da Faculdade de Medicina da UFRGS. Endereço: Rua João Abott, n ? 686. CEP 90430 - Porto Alegre, RS. Te/.: 331-2418. Recebido em 18/04/91. Para modificação do autor em 23!07/91. Recebido da última modificação em 02/09/91. Aceito para publi-cação em 09/09/91. R. AMRIGS, Porto Alegre, 35 (4): 199-201, out./dez., 1991 CARLOS THADEU SHIMIDT CERSKI* FERNANDO ROCHA DE OLIVEIRA** PATRÍCIA WARNCKE ASHTON** ADELIR BOLZZONI** ABSTRACT lmmunnoperoxidase Method in the diagnosis of malig-nant undifferentiated neop/asms The authors made a retrospective study o f 3 7 malignant undifferentiated neoplasms by im-munoperoxidase method, employing a sma/1 antibody pane/: leucocyte common antigens (LCAs), S100 pro-tein, Keratin (AE1). Although the previous technical processing had been inadequate the sensitivity of 57% and specificity of 100% were considered completely satisfactory. KEYWORDS: lmmunoperoxidase, Antibodies, Undifferentiated ne-oplasms, Diagnosis se é uma das mais empregadas 1• 2• 3 . Ela utiliza a es-pecificidade e a sensibilidade dos anticorpos para a identificação e a localização de antígenos em cortes de tecidos. Isso possibilita ao patologista não apenas o reconhecimento de alterações morfológicas, mas, também, de características antigênicas do tecido em exame. Hoje, existe uma infinidade de marcadores (an-ticorpos mono e policlonaisÍ disponíveis para a iden-tificação dos mais diversos antígenos de células neo-plásicas indiferenciadas. O alto custo desses marca-dores, porém, restringe a sua ampla utilização na roti-na do laboratório de patologia. O presente trabalho foi elaborado com o objetivo de avaliar a sensibilidade e a especificidade de um pai -nel mínimo de marcadores em neoplasias previamen-te classificadas como malignas e indiferenciadas no Serviço de Patologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), durante o período de dois anos. O pai-nel mínimo utilizado constitui-se de três anticorpos: antígeno comum leucocitário (LCA), proteína S-100 e ceratina de baixo peso molecular (AE1). MATERIAL E MÉTODOS Revisaram-se 4 7 casos previamente diagnostica-dos como neoplasias malignas indiferenciadas prove-199 lmunoperoxidase ... Cerski et alii nientes do Serviço de Anatomia Patológica do HCPA referentes ao período de janeiro de 1988 a dezembro de 1989. Esses casos corresponderam a 0,2~% do to-tal (18.727) de exames anatomopatológicos realizados no período. Quanto às características morfológicas, 27 (57%) eram constit uídos por neoplasias malignas de pequenas células (NMPC), 9 (19%) por neoplasias ma-lignas de células anaplásicas (NMCA), 6 (13%) por neoplasias malignas de células fus iformes (NMCF) e 5 (11%) por neoplasias malignas sem outras especifi-cações (NMSE). Todos os casos haviam sido incluídos em parafina e examinados através das colorações con-vencionais. Os marcadores utilizados foram: antígeno comum leucocitário (Dako mouse monoclonal anti -leucocyte common antigen-LCA, clone PD7/26 e ZB11, class lgG1,Kappa); proteína S100 (Dako rabbitt anti-cow S100-lgG fraction) e ceratina de baixo peso molecu-lar (Bio Genex Laboratories, mouse monoclonal low molecular weight citokeratin antibody, class lgG1-AE1) 3· 4, 5, 6, 7, a. A técnica utilizada foi a do sistema avidina-biotina, originalmente descrita por Hsu8 , com algumas modi-ficações. Inicia-se com duas etapas sucessivas de des-parafinização (a primeira poí 30 min com xilol I a 60 ° C e a segunda por 20 min com xilolll a temperatu-ra ambiente) seguidas de uma bateria de álcool para hi-dratação (5 etapas de 2 min com álcool absoluto I, 11, 111 , IV, V). Realiza-se, então, a lavagem em água cor-rente, com água destilada, e, posteriormente, o blo-queio da perox idase endógena com 10 volumes de H20 2 a 3% 2 vezes por 5 min. Após procede-se a nova lavagem em água corren-te, água destilada e tampão-fosfato. Posteriormente, adiciona-se tripsina, 15 a 20 mg em 100 ml de PBS + 134 mg de CaCI, com pH ajustado para 7,8 por 20 a 30 min, na temperatura de 37 °C. Adiciona-se o so-ro normal (da espécie animal do anticorpo secundá-rio) por 20 min, a 37 ° C. Escorre-se o soro normal e incuba-se com anticorpo primário por uma hora, a 3JDC. Posteriormente, realizam-se três lavagens em tam-pão-fosfato por 10 mine incuba-se o corte com o an-ticorpo secundário, a 37 °C, por 30 min, seguido de mais três lavagens de tampão, por 10 min. Logo após, acrescenta-se ABC (complexo avidina-biotina) por 30 mina 37 °C (1ul avidina + 1ul biotina + 1 ml PBS), seguidos de mais três lavagens em tampão-fosfato por 10 min. Acrescenta-se OAB (diaminobenzidina) por 3 min (30 mg de OAB + 100 ml de PBS + 1,2 ml de H2 0 2 10 volumes) . Lava-se em água corrente e água destilada. Por fim, realiza-se a contracoloração com hematoxilina de Mayer por 5 min, lava-se novamente com água corrente e água destilada, adiciona-se car-bonato de lítio. Após desidrata-se e monta-se. Como controles-positivos foram utilizados cortes de melanoma para a proteína S100, cortes de pele nor-mal para a citoqueratina AE1 e cortes de amígdala pa-latina para o controle de LCA. Como controles-negativos foram empregados os mesmos cortes aci-200 Artigos Originais ma, apenas substituindo-se os anticorpos primários por tampão-fosfato. RESULTADOS Do total de 4 7 casos previamente selecionados em nosso estudo, 10 (21,2%) foram perdas referen-tes a amostras sem tumor residual (3 casos= 6,4%), e o restante (7 casos=14,9%) foram amostras cujo material original foi completamente desgastado. Dos restantes 37 casos, 16 (43%) tiveram resultados ne-gativos para os 3 antígenos pesquisados. Os outros 21 casos (57 % ) mostraram positividade para apenas um dos 3 antígenos específicos. Assim, 8 casos (22%) foram positivos para AE1, 7 casos (19%) foram posi-tivos para LCA e 6 (16%) casos foram positivos para proteína S100. Nos 37 casos estudados, pudemos observar que 21 (57%) eram neoplasias malignas de pequenas cé-lulas (NMPC); 7 (19%) eram neoplasias malignas de células anaplásicas (NMCA); 6 (16%) eram neoplasias malignas de células fusiformes (NMCF) e 3 (8%) eram neoplasias malignas sem especificação da morfologia celular (NMSE) (Tabela 1). TABELA 1 - MORFOLOGIA X MARCADORES TUMORAIS AE1 LCA 5100 Neg . Total NMPC 5(14%) 7(19%) o (0% ) 9(24%) 21 (57 %) NMCA 3 (9 %) o (0%) 3 (8%) 1 (3 %) 7 (19 %) NMCF o (0%) o (0%) 2 (5% ) 4 (11 o/o ) 6 (16 %) NMSE o (0%) o (0%) 1 (3%) 2 (5 %) 3 (8% ) Total 8(22 %) 7(19 %) 6(16 %) 16(43% ) 37( 1 00 %) Fazendo a correlação das amostras positivas pa-ra um antígeno com a class ificação morfológica celu -lar, observamos que 5 dos casos positivos para AE1 eram NMPC e 3 NMCA, enquanto 7 casos LCA positi-vos corresponderam a NMPC. Dos casos positivos para S100, 3 eram NMCA, 2 eram NMCF e 1 era uma NMSE. Por fim, correlacionando as amostras negativas para os 3 antígenos com a classificação morfológica, observamos que 9 casos eram NMPC, 1 caso era NMCA, 4 casos eram de NMCF e 2 eram casos de neo-plasias malignas sem outras especificações. DISCUSSÃO Os 37 casos submetidos a este painel m1mmo apresentaram positividade para somente um ou ne-nhum dos marcadores utilizados. Esse achado confir-ma a boa especificidade (100%) dos marcadores, con-forme relatado na literatura4· 5, 6, 7, a. 9, 10. 11. A sensibilidade por nós encontrada foi de 57%, não reproduzindo os resultados de outros autores9, 1o, o que pode ser devido a pelo menos dois fatores. O primeiro deles diz respeito às NMI por nós examina-das: NMPC, NMCA e NMCF. Ou seja, não seleciona-mos os diferentes tipos de NMI. R. AMRIGS, Porto Alegre, 35 (4) : 199-201, out./dez., 1991 2 lmunoperoxidase ... Cerski et alii Enquanto isso, outros autores restringiram-se às NMPC ou NMCA, onde a dúvida diagnóstica correspon-de à diferenciação entre carcinoma x linfoma e carci-noma x melanoma, respectivamente, não incluindo as NMCP· 10 • O painel mínimo por nós utilizado, adequado na avaliação das NMI de pequenas células e células ana-plásicas, mostrou-se insuficiente quando o objetivo de análise são NMI de células fusiformes. O segundo fator estaria relacionado às condições técnicas da amostra estudada. O nosso material foi submetido a inclusão em parafina com temperatura superior a 60 °C e a tempos excessivamente longos de fixação em formalina não-tamponada 11 • Esses dois fatores são responsáveis pela destruição de antígenos celulares, o que determina o achado de resultados fal-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Hsu SM, Raine L. Protein A , and Biotin in lmmunohistoche-mistry. J Histochem Cytochem 1981; 29 (11): 1349-53. 2 Gatter KC, Alcock C, Heryet A, Mason DY. 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Apesar do material por nós examinados não ter segui9o um processamento técnico adequado, a utili -zação de um painel exíguo de anticorpos foi suficien-te para a resolução de 57% dos casos. Tal sensibili-dade, juntamente com a especificidade de 100% nu-ma amostra fixada em formalina e incluídos em para-fina sem cuidados prévios maiores, nos indica que o painel mínimo de anticorpos utilizados oferece um re-sultado plenamente satisfatório. Se acrescentarmos a isto alguns cuidados, como o controle de temperatu-ra da parafina durante a inclusão, uma fixação adequa-da e um painel de ant icorpos mais amplo especialmen-te para as neoplasias malignas de células fusiformes, a sensibilidade esperada deverá ser muito maior. ma with monoclonal anti leucocyte antibodies. N Engl J Med 1983; 309: 1275-81. 7 Kindblom LG, Lodding P. Rosengren L, Baudier J, Haglid K. 5100 protein in melanocytic tumors. Acta Path Microb lmmunol Scand Sect A 1984; 92: 219-30. 8 Hsu SM, Raine L, Fanger H. 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lmmunnoperoxidase method in the diagnosis of malignant undifferentiated neoplasms

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