Design of new ecto-5'nucleotidase (cd73) inhibitors as potential antitumor

Abstract

No Brasil, o câncer de bexiga é a oitava neoplasia mais incidente entre os homens. Estudos anteriores mostraram que a inibição da ecto-5’-nucleotidase (CD73), levou a uma redução significativa da proliferação de células de câncer de bexiga T24, além disso, outros estudos em células uroteliais de camundongo mostraram que a enzima CD73 é superexpressa somente em células malignas, tornando-se também um possível alvo seletivo.Nesta tese foram utilizadas uma série de ferramentas virtuais para elucidar os mecanismos envolvidos na captação de ligantes, bem como os bolsões disponíveis para interação na ecto-5’-nucleotidase. Os movimentos de abertura de fechamento, além do posicionamento peculiar de duas fenilalaninas (Phe500 e Phe417) fazem desta enzima uma máquina de capturar AMP. A quimioteca do LaSOM forneceu duas coleções de compostos para o estudo: cumarinas e dihidropirimidinonas (DHPMs). Desta forma, uma série de 152 cumarinas foram triadas virtualmente por métodos previamente validados onde foram selecionados o LaSOM 366 e o LaSOM 191 como ligantes, o que não foi confirmado no ensaio enzimático nas condições empregadas. A coleção de DHPMs investigada revelou o LaSOM 335 com inibição in vitro contra células de câncer de bexiga T24 (IC50=10,7μM). A análise in silico mostrou afinidade com a CD73 e as principais interações foram entre os fragmentos 3-nitrobenzeno e o resíduo Arg395, anel dihiropirimidinona com as fenilalaninas Phe500 e Phe417, e o anel aromático em N1 com o bolsão hidrofóbico do sítio ortostérico, que estabiliza o complexo formado. Estes estudos in silico foram ratificados com o ensaio enzimático, no qual o LaSOM 335 apresentou IC50=136,5μM. Soma-se que esta DHPM apresentou inibição do gene let-60 na cepa MT4244 de Caernobidiythis elegans, este gene é associado à codificação do gene Ras e a sua inibição diminue a adesão e migração do tumor. A análise do perfil toxicológico através de modelos in vivo (C. elegans) e in silico mostrou um composto com baixa toxicidade, concordando com dados anteriores do nosso grupo de pesquisa com as DHPMs. O conjunto de dados revelam que o LaSOM 335 é um candidato a potencial protótipo antitumoral. A possibilidade de atuar por no mínimo dois mecanismos de ação distintos devem ser investigados, principalmente a ação inibitória sobre a CD73.In Brazil, bladder cancer is the eighth most frequent neoplasm among men. Previous studies showed that the ecto-5'-nucleotidase (CD73) inhibition led to a significant reduction in the T24 bladder cancer cells proliferation, furthermore, other studies in mouse urothelial cells showed that the CD73 enzyme is overexpressed only in malignant cells, becoming also a possible selective target. In this work, a series of virtual tools were used to elucidate the mechanisms involved in the ligands uptake, as well as the available pockets for interaction in the ecto-5'-nucleotidase. The opening and closing movements, and the peculiar positioning of two phenylalanines (Phe500 and Phe417) make this enzyme a perfect machine to catch AMP molecules. The LaSOM library provided two scaffold of compounds for the study: coumarins and dihydropyrimidinones (DHPMs). Thus, a series of 152 coumarins were virtually screened by previously validated methods where LaSOM 366 and LaSOM 191 were selected as ligands. On the other hand, the activity was not confirmed in the enzymatic assay, under the used conditions. The investigated DHPMs collection revealed LaSOM 335 with in vitro inhibition against T24 bladder cancer cells (IC50=10.7μM). The in silico analysis showed affinity with CD73 and the LaSOM 335. The LaSOM 335 main interactions were between the 3-nitrobenzene fragments and the Arg395 residue, the dihyropyrimidinone ring and the phenylalanines Phe500 and Phe417, and the aromatic ring in N1 and the hydrophobic orthosteric site pocket, which stabilizes the complex formed. These in silico studies were confirmed with the enzymatic assay, in which LaSOM 335 presented IC50=136.5μM. In addition, this DHPM showed inhibition of the let-60 gene in the MT4244 strain of C. elegans. The let-60 gene is associated with the Ras gene coding. The Ras gene sinalization inhibition decreases tumor adhesion and migration. Analysis of the toxicological profile through in vivo (C. elegans) and in silico models showed a compound with low toxicity, corroborating previous data from our research group with DHPMs. The dataset reveals that LaSOM 335 is a candidate for a potential antitumor prototype. The possibility of acting by at least two distinct mechanisms of action should be investigated, mainly the inhibitory action on CD73