A chemical biology approach to study the 15 kDa granulysin mechanism of action

Abstract

La granulysine est une protéine sécrétée par les lymphocytes T cytotoxiques et les cellules NK en réponse à une infection chez l’humain. Elle est exprimée par ces cellules sous la forme d’une protéine de 15 kDa (15-GN) dont la maturation protéolytique conduit à une isoforme plus courte de 9 kDa (9-GN). La 9-GN est principalement cytotoxique et capable de tuer un grand nombre d’agents pathogènes comme les bactéries, les champignons, les virus ou les cellules tumorales. La 15-GN, longtemps considérée comme un simple précurseur de la 9-GN, est quant à elle dotée d’activités de type « alarmine immunitaire » et provoque l’activation, la maturation et la migration de différentes populations de cellules immunitaires. De nombreux travaux ont rapporté de précieuses informations sur la localisation, la structure et les fonctions de la 9-GN tandis que l’étude de la 15-GN est encore entourée de nombreuses zones d’ombre. De surcroît, cette protéine est extrêmement difficile à produire par les techniques recombinantes et toute entreprise de compréhension de ses propriétés structurales et biologiques s’en retrouve grandement compliquée. Face à cela, les méthodologies de synthèse chimique des protéines se révèlent être un atout précieux pour l’étude de la granulysine 15 kDa. En plus de rendre possible sa synthèse, les méthodes chimiques permettent l’introduction précise de modifications pour l’étude des relations structure-fonction de cette protéine et pour générer des outils moléculaires utiles pour élucider son mécanisme d’action.Après un premier chapitre introductif présentant les grandes méthodes de synthèse chimique des protéines et leurs apports à l’étude de protéines d’intérêt biologique, un état des connaissances exhaustif sur la granulysine sera dressé. S’en suivront quatre chapitres rapportant les résultats collectés au cours de cette étude. Le premier chapitre présentera les différentes optimisations qui ont conduit au développement d’un procédé de synthèse chimique de la 15-GN. Le deuxième chapitre présentera la synthèse d’une série d’analogues de la 15-GN pour l’étude des relations structure-fonction de cette protéine. Le troisième chapitre détaillera l’approche adoptée pour la recherche de partenaires d’interaction de la 15-GN au moyen d’un analogue biotinylé. Enfin, le dernier chapitre se focalisera sur le développement d’un catalyseur de la réaction d’échange thiol/thioester ; un outil précieux pour la synthèse de la 15-GN et plus largement pour le domaine de la chimie de ligation.Granulysin is a human protein secreted by cytotoxic T lymphocytes and NK cells in response to infections. It is expressed by these cells as a 15 kDa protein (15-GN) whose proteolytic processing leads to a shorter 9 kDa isoform (9-GN). 9-GN is broadly cytotoxic and capable of killing various bacteria, fungi, viruses and cancer cells. Originally thought as a 9-GN precursor, 15-GN actually features alarmine properties and causes activation, maturation and migration of different immune cells. Number of studies have reported precious information on the localization, the structure and the functions of 9-GN while many grey areas remain on 15-GN study. In addition, the production of this protein in recombinant systems is extremely difficult and every attempt to understand its structural and biological properties is thus complicated. In this context, chemical protein synthesis proves to be a valuable asset for the study of 15 kDa granulysin. Furthermore, chemical methods allow the precise introduction of modifications to study the structure-function relationships of this protein and to generate molecular tools to elucidate its mechanism of action.Following an opening chapter on main methods for chemical protein synthesis and their contribution to the study of biologically relevant proteins, an exhaustive state of knowledge on granulysin will be drawn up. Four chapters will follow, reporting the results collected during this study. A first one will present the various optimizations conducted toward the development of a chemical process for native 15-GN synthesis. A second will present the synthesis of an analog library designed to study the structure-function relationships of this protein. In a third chapter the search for interaction partners of 15-GN by means of a biotinylated analog will be reported. Finally, the last chapter will focus on the development of a catalyst for the thiol/thioester exchange reaction; a valuable tool for the synthesis of 15-GN and for the field of ligation chemistry