Streptococcus pyogenes (also known as Group A Streptococcus, GAS) is a capsulated Gram-positive, human-adapted pathogen. GAS strains express different virulence factors exposed on the bacterial surface or secreted outside the cell. Among the secreted virulence factors, superantigens (SAGs) are certainly the most toxic factors. A recent study demonstrates that, in vitro, the streptococcal superantigen SpeI interacts with AdcA and Lmb, the substrate binding subunits of the two zinc transporters. In particular, AdcA belongs to the high-affinity zinc transporter Adc, involved in adhesion, competence and zinc uptake. Zinc is an essential micronutrient for all living organisms but cells have to tightly control its intracellular concentration due to its toxicity.
In this thesis the role of adcA in zinc uptake in GAS was studied. Three independent ΔadcA null mutants were generated in the strain MGAS5005, and their phenotype was characterised. The mutants were obtained by means of the low copy number temperature-sensitive shuttle vector pJRS233. Deletion of the adcA gene in Streptococcus pneumoniae leads to a dramatic decrease in competence. Thus, complementation using the pMU1328 plasmid was obtained by transforming the intermediate strain MGAS5005::pJRS233-ΔadcA that still contains the wild type adcA allele.
The absence of a zinc transporter affects the capacity to uptake zinc from the culture medium and the mutant susceptibility to zinc starvation. The Δadca null mutants clearly displayed a higher sensitivity to zinc starvation compared to the wild type strain. The complementation of one of the mutants with the wild type gene restored the phenotype. When the ΔadcA mutant is grown in the presence of the zinc chelator TPEN, growth is rescued both by zinc or manganese. This probably means that the import of these two metals is carried out by the other zinc transporter Lmb, coded within the operon lmb-htpA. Hence, the expression of Lmb and HtpA was analysed by Western blot in different growth conditions. In wild type cells AdcA is always expressed at a high level, whereas Lmb and HtpA are highly expressed only in zinc-depleted medium or in ΔadcA mutants. This finding supports the notion that AdcA is functionally homologous to ZnuA, the major high affinity zinc transporter in many bacteria, and like ZnuA is responsible for the efficient recruitment of zinc in most conditions.Streptococcus pyogenes (detto anche Streptococco di gruppo A, GAS) è un batterio Gram-positivo capsulato, adattato ad infettare l’uomo. I ceppi di GAS esprimono diversi fattori di virulenza che possono essere esposti sulla superficie esterna o secreti fuori dalla cellula. Tra i fattori di virulenza, i Superantigeni (SAGs) sono sicuramente tra i più nocivi per l’ospite. Uno studio recente ha dimostrato che in vitro SpeI, un superantigene secreto da GAS, interagisce con AdcA a Lmb, due proteine che trasportano lo zinco. In particolare, AdcA appartiene al trasportatore ad alta affinità Adc, che è coinvolto nell’adesione, nella competenza e nel trasporto dello zinco. Questo metallo è un microelemento essenziale per tutti gli organismi viventi, ma poiché possiede una elevata tossicità, le cellule devono regolare finemente la sua concentrazione intracellulare.
In questo lavoro di tesi è stato studiato il ruolo di AdcA nel trasporto dello zinco in GAS. Per questo studio sono stati generati tre mutanti indipendenti nel ceppo MGAS5005, caratterizzandone il loro fenotipo.
I mutanti sono stati ottenuti mediante l’uso del vettore termosensibile pJRS233. La delezione del gene adcA in Streptococcus pneumoniae comporta una notevole diminuzione della competenza, quindi la complementazione è stata ottenuta trasformando il mutante parziale, cioè l’ “eterozigote” intermedio che contiene sia l’allele wild type che quello mutato. L’assenza del trasportatore dello zinco influisce sulla capacità di importare lo zinco dal terreno di coltura e sulla suscettibilità alla mancanza di zinco. I mutanti ΔadcA mostrano chiaramente una maggiore sensibilità alla deprivazione di zinco se comparati con il ceppo wild type. La complementazione di uno dei mutanti riporta il fenotipo del mutante a quello del ceppo wild type. Quando il mutante è cresciuto in presenza di una concentrazione inibente del chelante TPEN, la crescita è ristabilita dalla aggiunta di zinco o di manganese. Questo probabilmente significa che il trasporto di questi due metalli può avvenire tramite l’altro trasportatore Lmb, codificato all’interno dell’operone lmb-htpA. Di conseguenza, l’espressione di Lmb e HtpA è stata analizzata tramite Western blot in condizioni di crescita diverse. Nelle cellule wild type AdcA è sempre espresso ad alti livelli, invece Lmb e HtpA sono espresse ad alti livelli solo nel terreno di coltura depleto di zinco. Questo risultato avvalora il concetto che AdcA è omologo da un punto di vista funzionale a ZnuA, il maggior trasportatore ad alta affinità dello zinco in molti batteri, e come ZnuA ha il compito del reclutamento dello zinco in molte condizioni
