Intrinsic and acquired resistance to conventional and targeted chemotherapeutics is the fundamental reason for treatment failure in many cancer patients. Identifying molecular mechanisms involved in drug resistance or sensitization to targeted therapy is of enormous clinical importance. Critical transcription factors such as forkhead box O (FOXO) proteins and p53 have been shown to mediate the action of multiple anti-cancer drugs. Our lab discovered a novel mechanism of drug resistance facilitated by TRIB2 by activating AKT and, consequently, the inactivation of both FOXO and p53. Furthermore, this lab has established TRIB2 as a potential biomarker for melanoma, and its expression correlated with disease stage (I-IV). As TRIB2 may potentially be used as a biomarker and confers resistance to several standard front-line therapeutics to treat melanoma, these results are extremely relevant for the clinical management of melanoma. While accounting for less than 5% of all skin cancer patients, melanoma is the deadliest form of skin cancer, responsible for over 90% of all skin cancer deaths.
Furthermore, metastatic melanoma incidence has increased over the past three decades, with a mortality rate that continues to rise faster than almost all other cancers. Genetic analyses of melanoma have uncovered several key pathways in disease onset and progression, most prominently are the Ras/Raf/MEK/ERK and the PI3K/AKT/FOXO signalling pathways. In the decades 70 and 80, the established treatment for metastatic melanoma included high-dose interleukin-2 or dacarbazine (DTIC) administration associated with response rates of between 10-20% with severe side effects during treatment. The limited success prompted investigators to further characterize and understand the disease, leading to the development of immunotherapy, namely immune checkpoint inhibitors (pembrolizumab, nivolumab and ipilimumab), and targeted therapy, namely the BRAF inhibitors vemurafenib and dabrafenib and the MEK inhibitor trametinib, which are approved to treat melanoma patients with mutated BRAF (about 50% of patients). Simultaneously, several PI3K, AKT, mTOR, and MEK inhibitors have been tested in clinical trials but, intrinsic or acquired resistance limits the efficacy of all these treatments. Our lab has previously shown that the tumour suppressor FOXO is the central downstream transcriptional mediator of the PI3K/AKT pathway after PI3K inhibition, which is in accordance with other studies that also show that FOXOs are crucial for the anti-cancer action of several drugs, in particular, PI3K pathway inhibitors. Therefore, proteins capable of inactivating FOXO factors are good candidates for mediating tumour formation, progression and resistance to these agents. Strikingly, our lab previously established TRIB2 as an oncogenic protein that suppresses FOXO factors in melanoma and induces resistance to the dual PI3K/mTOR inhibitor BEZ235 (dactolisib). We hypothesize that TRIB2 mediates therapy resistance by altering the gene expression profile of the cells, and we can pharmacologically reverse these effects of TRIB2.
To characterize the downstream events of TRIB2 activity, we analyzed the gene expression profiles of isogenic cell lines with different TRIB2 statuses by RNA sequencing. Using a connectivity map-based computational approach, we identified drug-induced gene-expression profiles that invert the TRIB2-associated expression profile. The natural alkaloids harmine and piperlongumine produced inverse gene expression profiles and synergistically increased BEZ235-induced cell toxicity. Notably, both agents promote FOXO nuclear translocation without interfering with the nuclear export machinery and induce transcription of FOXO target genes. Our results highlight the great potential of this approach for drug repurposing and suggest that harmine and piperlongumine or similar compounds might help overcome TRIB2-mediated therapy resistance in cancer patients.Os pacientes oncológicos sujeitos a quimioterapia convencional e dirigida, nem sempre obtêm um resultado clínico positivo. Uma das principais razões é a resistência ao tratamento intrínseca e adquirida. Como tal, é de extrema importância clínica identificar e caracterizar os mecanismos moleculares envolvidos na resistência ao tratamento oncológico e promover a resensitização do paciente à terapêutica dirigida.
Diversos factores de transcrição, dos quais as proteínas forkhead box O (FOXO) e p53 são as mais conhecidas, têm sido identificados como principais responsáveis pela modulação da eficácia de diversos fármacos anti-cancro. O nosso laboratório identificou previamente um novo mecanismo de resistência à terapêutica oncológica originada pela proteína TRIB2. O TRIB2 activa a proteína AKT, o que leva à inibição dos factores de transcrição FOXO e p53. Adicionalmente, o nosso laboratório demonstrou que o TRIB2 mostra potencial como biomarcador em melanoma, em que a expressão de TRIB2 correlaciona-se com o avançar do estadio da doença (I-IV). Tendo em conta que o TRIB2 poderá ser um biomarcador e também confere resistência a diversas estratégias terapêuticas no tratamento do melanoma, estes resultados são extremamente relevantes para o futuro da terapêutica em melanoma (a incidência de novos casos de melanoma nos Estados Unidos da America é de 73870). Embora só 5% dos pacientes com cancro de pele sejam diagnosticados com melanoma, esta doença é no entanto a mais fatal de todos os cancros de pele, responsável por mais de 90% de falecimentos de pacientes com cancro de pele.
Além do mais, a incidência de melanoma metastático tem aumentado nas últimas três décadas, caracterizada por uma taxa de mortalidade superior a todos os restantes cancros. Análises genéticas ao melanoma permitiram a identificação de diversas vias de sinalização envolvidas na origem e na progressão da doença, principalmente as vias de sinalização Ras/Raf/MEK/ERK e PI3K/AKT/FOXO. Nas décadas de 70 e 80, a terapêutica standard para o melanoma metastático incluía administração de doses elevadas de interleucina 2 or dacarbazina (DTIC), usualmente com taxas de resposta clínica positiva de 10 a 20%, mas como efeitos secundários severos durante o tratamento. A sua eficácia limitada impulsionou o estudo e a caracterização da doença, o que levou ao surgimento de immunoterapia, nomeadamente inibidores de immune checkpoints (pembrolizumab, nivolumab e ipilimumab), e terapia dirigida, nomeadamente os inibidores de BRAF, como o vemurafenib e dabrafenib, e os inibidores de MEK como o trametinib, que se encontram-se aprovados para o tratamento de melanoma em pacientes com mutações em BRAF, que ocorrem em cerca de 50% dos pacientes diagnosticados com melanoma. Adicionalmente, também estão a ser estudados em ensaios clínicos, diversos inibidores the PI3K, AKT, mTOR e MEK, no entanto, a eficácia destas terapêuticas é de momento limitada devido à presença de resistência ao tratamento intrínsica e adquirida em diversos pacientes. Como tal, é necessário o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, que visam reverter esta resistência.
O nosso laboratório demonstrou previamente que o suppressor de tumor FOXO é o principal mediador de transcrição regulado pela via sinalização PI3K/AKT, após a inibição de PI3K. Estes resultados encontram-se de acordo com a literatura que demonstra que os factores de transcrição FOXO são os principais moduladores da eficácia de fármacos, nomeadamente os inibidores da via de sinalização PI3K. Portanto, proteínas que sejam capazes de inactivar FOXO, são potenciais candidatos como responsáveis pela formação e progressão de tumores, e de aparecimento de resistência ao tratamento destas patologias.
Notavelmente, o nosso laboratório estabeleceu previamente TRIB2 como uma proteína oncogénica que inibe os factores de transcrição FOXO em melanoma, e outros estudos demonstraram que TRIB2 também se comporta como um oncogene em diversos tumores sólidos, como os cancros do pulmão, colorectal e fígado. Tanto o nosso laboratório como outros estudos, demonstrou-se que TRIB2 confere resistência a diversos fármacos para o tratamento de cancro, incluindo inibidores de PI3K/mTOR , gemcitabina, dacarbazina e temozolomida. A resistência mediada por TRIB2 é causada por activação de AKT por TRIB2. Mecanisticamente, TRIB2 tem preferência em se ligar directamente a AKT1 cataliticamente inactivo (resíduo treonina 308 não fosforilado), o que induz a fosforilação de AKT no resíduo serina 473 em células humanas, indicando o aumento da actividade catalítica de AKT. A activação de AKT via TRIB2, resulta na inibição de FOXO, o que por sua vez altera a expressão de genes alvo de FOXO, incluindo a redução da expressão de genes envolvidos na regulação da apoptose. Consequentemente, a apoptose resultante da terapêutica oncológica, é diminuida na presença de elevados níveis de TRIB2. Um exemplo de um fármaco cuja eficácia é diminuida na presença de TRIB2, é o derivado de imidazoquinolina, conhecido como BEZ235. Este composto é um inibidor de PI3K e mTOR, que consiste numa molécula de baixo peso molecular que compete com o ATP pelo sítio cataliticamente activo nestas cinases. A eficácia de BEZ235 tem sido avaliada em vários ensaios clínicos, e muitos outros inibidores de PI3K e mTOR têm sido aprovados para uso clínico para vários tipos de cancro. Interferir com a actividade de TRIB2 poderá ser uma potencial estratégia terapêutica para o tratamento de vários tipos de cancro, especialmente no contexto de superar a resistência ao tratamento.
Neste estudo, pretendemos caracterizar os efeitos de TRIB2 a nível molecular e identificar estratégias farmacológicas que possam interferir com a sua actividade. Para avaliar a contribuição dos efeitos de TRIB2 em células humanas, procedemos à criação de linhas celulares humanas de osteosarcoma (U2OS) isogénicas, com níveis de expressão de TRIB2 elevada e baixa, respectivamente. Estas linhas celulares também foram tratadas com BEZ235 para avaliar os efeitos de TRIB2 na resistência ao tratamento. Seguidamente, procedemos à sequenciação de RNA para analisar o perfil de expressão génica induzido por TRIB2, nas células não tratadas e tratadas com BEZ235. A sobreexpressão de TRIB2 resultou na alteração da expressão de genes envolvidos na proliferação, apoptose e migração celulares, incluindo genes alvo de FOXO e p53. Na tentativa de identificar potenciais fármacos ou compostos que possam interferir na actividade de TRIB2, utilizámos o perfil de expressão génica induzido por TRIB2 para identificar compostos que induzissem um perfil de expressão génica oposto ao do TRIB2, utilizando uma ferramenta denominada de connectivity Map. Entre os compostos identificados, procedemos à validação dos compostos naturais alcalóides, harmina e piperlongumina, que não só apresentam um perfil de expressão génica oposta ao TRIB2, como também demonstraram um efeito sinérgico com o tratamento BEZ235, induzindo toxicidade cellular na presença de TRIB2, comparando com o tratamento BEZ235 sozinho. Notavelmente, harmina e a piperlongumina promoveram a translocação nuclear de FOXO, sem interferir com os mecanismos de exportação nuclear, e que foi consistente com FOXO sendo transcripcionalmente activo, resultando na indução da transcrição de genes alvo de FOXO.
Os nossos resultados indicam o potencial desta estratégia terapêutica, recorrendo ao reaproveitamento de fármacos, e sugere que harmina, piperlongumina e outros compostos similares possam vir a ser úteis na clínica para superar a resistência induzida por TRIB2 no tratamento oncológico em pacientes
