Extrazelluläre Purine tragen maßgeblich zur Regulation des inflammatorischen Milieus bei: Während ATP als proinflammatorisches Alarmin wirkt, vermittelt Adenosin entzündungshemmende Effekte. Das Gleichgewicht dieser Adeninmetabolite wird im Wesentlichen durch die Ektonukleotidasen Ektonukleosidtriphosphatdiphosphohydrolase 1 (CD39) und Ekto-5'-
Nukleotidase (CD73) vermittelt, die ATP über AMP zu Adenosin verstoffwechseln. AMP-Desaminasen (AMPD) sind Enzyme des intrazellulären Purinstoffwechsels, die die Desaminierung von AMP zu IMP katalysieren. Damit erleichtern sie einerseits den Abbau von ATP und verringern andererseits den AMP-Bestand für die Adenosin-Produktion durch CD73. An der Zelloberfläche humaner Immunzellen ist dieser Mechanismus bisher nicht beschrieben. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Expression von AMPD2 an der Oberfläche humaner Leukozyten sowie deren Regulation unter inflammatorischen Bedingungen.
Mittels Immunpräzipitation (IP) aus Membranfraktionen sowie durch Anreicherung des Oberflächenproteins mittels Oberflächenbiotinylierung wiesen wir AMPD2 in der Plasmamembran von HEK293 Zellen, HMEC-1 Zellen, U-937 Zellen und CD14+ Monozyten nach. Der Proteinnachweis erfolgte mittels Western Blot und Massenspektrometrie. Zusätzlich visualisierten wir die Oberflächenexpression immunfluoreszenzmikroskopisch auf U-937 Zellen sowie auf humanen mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut (PBMCs). Durchflusszytometrisch zeigten wir eine signifikante Steigerung der Expression der oberflächlichen
AMPD2 (eAMPD2) auf humanen Monozyten nach Toll-like-Rezeptor (TLR)-Stimulation (p=0,0078) sowie eine Reduktion dieser durch Inhibition des sekretorischen Wegs (p=0,0078). Durch die zusätzliche Behandlung mit Dexamethason (Dex) ließ sich der Effekt der Immunstimulation teilweise reduzieren. Im Vergleich zu bezüglich Geschlecht und Alter vergleichbaren
Kontrollen zeigten PBMCs von Patient*innen mit rheumatoider Arthritis (RA) eine erhöhte Grundexpression von eAMPD2. Eine erhöhte eAMPD2-Expression auf CD14+ Monozyten war nicht mit einer Reduktion der extrazellulären Adenosinkonzentration (eADO) verbunden. Hingegen konnten wir das anti-inflammatorische Potential von extrazellulärem IMP im Sinne einer Reduktion der Sekretion von Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) durch PBMCs nachweisen.
Zusammenfassend identifiziert diese Arbeit erstmals eAMPD2 als Ektoenzym auf humanen Immunzellen als neuen Regulator des extrazellulären Purinstoffwechsels. Durch AMP-Verbrauch könnte die Desaminase den Abbau von proinflammatorischem ATP erleichtern und das bestehende System der Ektonukleotidasen CD39 und CD73 um die Produktion des langlebigen anti-inflammatorischen Moleküls IMP ergänzen.Extracellular purine metabolites are powerful mediators of the inflammatory milieu: ATP acts as a pro-inflammatory alarmin, while adenosine represents a potent anti-inflammatory molecule. The ectonucleotidases ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (CD39) and ecto-5'-nucleotidase (CD73) regulate the balance of these metabolites by catalysing the sequential degradation of ATP to adenosine via AMP. Intracellular AMP deaminases (AMPD) mediate AMP deamination to IMP. Thereby, they facilitate degradation of ATP on the one hand and impair adenosine production by reducing AMP supply for CD73 on the other hand. The mechanism of AMP deamination has not yet been recognised on the surface of immune cells. This study examined the surface expression of AMPD2 in human leukocytes and its modification under inflammatory conditions.
We performed immunoprecipitation (IP) from membrane fractions as well as enrichment of surface protein by surface biotinylation to detect AMPD2 in the plasma membrane of HEK293 cells, HMEC-1 cells, U-937 cells and CD14+ monocytes. The enzyme was identified by western blot and mass spectrometry. Additionally, surface expression was visualised with the help of immunofluorescence microscopy of U-937 cells and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Flow cytometry revealed a significant increase in surface AMPD2 (eAMPD2) expression on human monocytes after toll-like receptor (TLR) stimulation (p=0.0078), while a reduction was observed after Golgi transport inhibition (p=0.0078). Concomitant incubation with dexamethasone (Dex) partly prevented the increase caused by immunostimulation. PBMCs from patients with rheumatoid arthritis (RA) showed an elevated expression of eAMPD2 compared to sex- and age-matched healthy controls. An increase in eAMPD2 expression on
CD14+ monocytes was not associated with reduced levels of extracellular adenosine (eADO). On the other hand, we verified the anti-inflammatory potential of extracellular IMP by demonstrating a reduction in tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) secretion from PBMCs.
In summary, this study shows AMPD2 surface expression on human immune cells for the first time and thereby identifies a novel ectoenzyme in the extracellular purine metabolism. We hypothesise that the deaminase enhances the degradation of pro-inflammatory ATP by removing AMP from the extracellular space and adds the production of long-lived anti-inflammatory IMP to the existing system of ectonucleotidases
